胡江偉,周 江,朱 璇,阿塔吾拉·鐵木爾,吳 斌,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,新疆烏魯木齊 830091)

一氧化氮對(duì)新疆伽師瓜果實(shí)采后貯藏品質(zhì)的影響

胡江偉1,周 江1,朱 璇1,阿塔吾拉·鐵木爾2,吳 斌2,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,新疆烏魯木齊 830091)

以新疆伽師瓜為試材,研究不同濃度一氧化氮(NO)熏蒸處理對(duì)伽師瓜果實(shí)采后品質(zhì)的影響。分別采用40、60、80μL/L NO熏蒸處理伽師瓜果實(shí)3h,貯藏于低溫冷庫(5±0.5℃)中。通過失重率、硬度、可溶性固形物(TSS)、可滴定酸、呼吸速率、乙烯釋放量、丙二酸(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性變化的測(cè)定,篩選出NO處理伽師瓜的適宜濃度。結(jié)果表明,60μL/L NO處理能較好地保持伽師瓜果實(shí)的硬度,延緩失重率的上升;抑制可溶性固形物、可滴定酸含量的下降;抑制果實(shí)的呼吸速率、乙烯釋放量;降低MDA的含量;能夠明顯地誘導(dǎo)SOD、POD、CAT活性的增加,增強(qiáng)果實(shí)的抗氧化能力。

伽師瓜,一氧化氮(NO),品質(zhì)

新疆伽師瓜(Cucurbitaceaemelovar.saccharinusNaud)屬晚熟厚皮甜瓜,因其產(chǎn)于得天獨(dú)厚的暖溫帶大陸性干旱氣候地理環(huán)境,賦予伽師瓜肉厚質(zhì)細(xì)、香甜清脆、汁濃、皮薄、含糖量高、果皮致密無網(wǎng)紋和耐貯運(yùn)等特點(diǎn),成為新疆瓜果中的珍品[1]。由于受伽師瓜時(shí)間性、地域性等特點(diǎn),造成伽師瓜成熟時(shí)大量涌入市場(chǎng),形成市場(chǎng)短期積壓,加上果實(shí)糖度較高,水分含量較大,生理代謝旺盛,采后易發(fā)生霉變和腐爛,給伽師瓜的貯藏運(yùn)輸、拓寬市場(chǎng)、延長營銷時(shí)間等帶來巨大困難,造成大量的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。因此,延長伽師瓜貯藏運(yùn)輸期,提高外銷伽師瓜商品質(zhì)量,創(chuàng)造更大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益是市場(chǎng)所急需解決的課題。

一氧化氮(NO)是一種小分子信號(hào)物質(zhì),自1987年生物體內(nèi)源一氧化氮合成機(jī)制被發(fā)現(xiàn)及其生理特性被證實(shí)以來[4],它在植物體內(nèi)作為一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子通過調(diào)控多種基因的表達(dá),實(shí)現(xiàn)對(duì)植物的呼吸作用、光形態(tài)建成、種子萌發(fā)、根和葉片的生長發(fā)育、氣孔運(yùn)動(dòng)、果實(shí)蔬菜等組織的成熟衰老和各種脅迫的響應(yīng)及抗病防御反應(yīng)等生理過程的調(diào)節(jié)[5-7]。目前,NO作為一種生物活性分子已經(jīng)被證明可以通過抑制呼吸速率來延緩果蔬的成熟衰老[8-9],從而增強(qiáng)果蔬在貯藏過程中抵御逆境的能力,延長貨架壽命和改善貯藏品質(zhì)[10]。近年來,國內(nèi)外研究者已開始關(guān)注NO在果蔬貯藏保鮮中的應(yīng)用,通過研究發(fā)現(xiàn)利用NO短時(shí)熏蒸能夠增強(qiáng)果蔬的保鮮效果,延長果蔬貨架期[11]。因此,本文以新疆伽師瓜為研究試材,采用不同濃度NO處理伽師瓜,篩選出適宜的NO處理濃度,研究NO處理對(duì)伽師瓜采后生理參數(shù)的影響,以期尋找出伽師瓜果實(shí)貯藏的最適濃度為延緩果實(shí)采后成熟衰老進(jìn)程,保持果實(shí)品質(zhì)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

伽師瓜采自庫車縣商品瓜基地。選擇大小均一,帶T型蔓果柄、無機(jī)械傷、無病蟲害果實(shí),外套發(fā)泡網(wǎng)裝箱,防止運(yùn)輸過程中碰撞損傷。將伽師瓜常溫運(yùn)輸置冷庫(5±0.5)℃中。NO氣體(純度99.9%) 廣州世源氣體有限公司。

GY-4硬度計(jì);SENTRY ST303型CO2分析儀 臺(tái)灣先馳;WYT-4手持折糖儀;森羅CNX-103型乙烯分析儀;FW-80高速萬能粉碎機(jī);UV-2600紫外分光光度計(jì) 日本島津;CR-20B2大型臺(tái)式冷凍離心機(jī) Himac;DW-86L626 -80℃超低溫冰箱 海爾;YC-260L 4℃冰箱 中科美菱。

1.2 處理方法

將采收后的伽師瓜果實(shí)放置于低溫冷庫(5±0.5℃)中預(yù)冷24h,具體操作參照郭芹等方法[12]。在5℃條件下,將伽師瓜置于密封的氣調(diào)箱內(nèi),進(jìn)行以下處理:對(duì)照(CK):密閉3h;NO處理:通入NO氣體,使NO濃度為40、60和80μL/L,熏蒸3h,隨后低溫貯藏。NO熏蒸處理,觀察其處理效果。每個(gè)處理重復(fù)三次,每個(gè)重復(fù)50個(gè)樣品。上述各處理完畢后通風(fēng)0.5h,置于冷庫低溫(5±0.5)℃貯藏。在貯藏過程根據(jù)伽師瓜表型觀察變化取樣,將果實(shí)橫切,取伽師瓜果實(shí)直徑最大部分的果肉用液氮冷凍置于-80℃超低溫冰箱中保存,備于生理指標(biāo)的測(cè)定。每處理取3個(gè)瓜來進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定,重復(fù)3次。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 失重率的測(cè)定 采用直接稱重法。果實(shí)失重率(%)=(果實(shí)始重-失水后重量)/果實(shí)始重×100

1.3.2 硬度的測(cè)定 采用國產(chǎn)GY-4型硬度計(jì)測(cè)定。

1.3.3 可溶性固形物含量的測(cè)定 采用手持折糖儀(WYT-4)測(cè)定。

1.3.4 呼吸速率的測(cè)定 采用CO2分析儀(SENTRY ST303型)測(cè)定。

1.3.5 乙烯釋放量的測(cè)定 采用乙烯分析儀(森羅CNX-103型)測(cè)定,方法同呼吸強(qiáng)度測(cè)定。

1.3.6 可滴定酸含量的測(cè)定 采用酸堿滴定法測(cè)定[13]。

1.3.7 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定 參考陳德碧等[14]方法。

1.3.8 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定 采用NBT法測(cè)定[15]。

1.3.9 過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定 采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[16]。

1.3.10 過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定 參考Beers等[17]方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0和Sigma Plot 12.0(Systat Software Inc,San Jose,CA,USA)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO處理對(duì)伽師瓜失重率的影響

由圖1可知:伽師瓜在貯藏過程中失重率都隨著貯藏時(shí)間的延長而逐漸上升。整個(gè)貯藏過程中,經(jīng)40μL/L和60μL/L NO處理的伽師瓜失重率均低于對(duì)照果實(shí),而NO處理濃度為80μL/L伽師瓜果實(shí)的失重率顯著高于對(duì)照果實(shí)(p<0.05)。貯藏結(jié)束時(shí),NO處理濃度為40,60,80μL/L和對(duì)照果實(shí)的失重率分別為3.10%、2.84%、4.23%和3.93%。由此表明,40μL/L和60μL/L NO處理可以延緩伽師瓜果實(shí)失重率的上升,且60μL/L NO處理較好?？梢员３仲煿瞎麑?shí)水分,減緩果實(shí)失重率的增加。但80μL/L處理加快了果實(shí)失重率的上升。

圖1 NO處理對(duì)伽師瓜失重率的影響Fig.1 Effect of NO on the weight loss of ‘JiaShi’ Muskmelon

2.2 NO處理對(duì)伽師瓜硬度的影響

果實(shí)硬度是衡量伽師瓜果實(shí)貯藏品質(zhì)的重要指標(biāo),也是判斷商品性的重要因素之一。伽師瓜在貯藏前期果實(shí)硬度最高,隨著貯藏時(shí)間的延長,果實(shí)硬度不斷下降。由圖2可知,貯藏前期經(jīng)NO處理的伽師瓜果實(shí)硬度均比對(duì)照果實(shí)高,但隨著貯藏時(shí)間的延長而下降,以60μL/L NO處理下降速度最為緩慢。貯藏結(jié)束時(shí),經(jīng)60μL/L NO處理和對(duì)照的硬度分別是24.27N和20.09N,60μL/L NO處理的果實(shí)硬度明顯高于對(duì)照(p<0.05)。說明,60μL/L NO處理可有效延緩伽師瓜貯藏過程中果實(shí)硬度的下降。

圖2 NO處理對(duì)伽師瓜硬度的影響Fig.2 Effect of NO on the hardness of ‘JiaShi’ Muskmelon

2.3 NO處理對(duì)伽師瓜可溶性固形物含量(TSS)的影響

由圖3可知:伽師瓜果實(shí)貯藏過程中,TSS含量逐漸下降。經(jīng)NO處理的果實(shí)在貯藏過程中趨勢(shì)與對(duì)照一致,呈下降趨勢(shì),但平均水平高于對(duì)照。貯藏結(jié)束時(shí),40,60,80μL/L NO處理的伽師瓜和對(duì)照果實(shí)的TSS含量分別為9.09%、11.69%、9.73%和8.71%,60μL/L NO處理的可溶性固形物含量明顯高于對(duì)照(p<0.05),且比其他處理都高,一直維持較高的水平,且下降趨勢(shì)較為緩慢。結(jié)果表明,60μL/L NO處理可以減緩TSS的下降趨勢(shì),延長伽師瓜的風(fēng)味保持。

圖3 NO處理對(duì)伽師瓜可溶性固形物含量的影響Fig.3 Effect of NO on the TSS of ‘JiaShi’ Muskmelon

2.4 NO處理對(duì)伽師瓜呼吸速率的影響

呼吸速率是衡量伽師瓜生理狀態(tài)的重要指標(biāo)。由圖4所示,經(jīng)60μL/L NO處理伽師瓜果實(shí)的呼吸速率在整個(gè)貯藏過程中都比對(duì)照果實(shí)低。伽師瓜是呼吸躍變型果實(shí),在貯藏21d時(shí),出現(xiàn)呼吸高峰,之后開始下降;40,60,80μL/L NO處理的伽師瓜和對(duì)照果實(shí)的峰值分別為7.12、6.54、7.5099、7.7897mg·kg-1·h-1,對(duì)照果的呼吸強(qiáng)度是60μL/L NO處理果的1.19倍,差異顯著(p<0.05)。貯藏結(jié)束時(shí),60μL/L NO處理果和對(duì)照果實(shí)的呼吸速率分別是6.18mg·kg-1·h-1和7.01mg·kg-1·h-1,差異顯著(p<0.05)。說明,60μL/L NO處理可以明顯降低伽師瓜整個(gè)貯藏過程中的呼吸速率。

圖4 NO處理對(duì)伽師瓜呼吸速率的影響Fig.4 Effect of NO on the respiratory rate of ‘JiaShi’ Muskmelon

2.5 NO處理對(duì)伽師瓜乙烯釋放量的影響

乙烯是植物體內(nèi)的一種重要激素,在果實(shí)成熟衰老過程中起著重要作用。由圖5可知,在整個(gè)貯藏期間,經(jīng)NO處理的果實(shí)在貯藏過程中趨勢(shì)與對(duì)照一致,呈先上升后下降趨勢(shì)。伽師瓜果實(shí)在貯藏21d時(shí),出現(xiàn)了乙烯釋放高峰,貯藏后期迅速下降;對(duì)照和40,60,80μL/L NO處理的伽師瓜乙烯釋放量最高值分別是1.332、1.1564、1.0262、1.8632μL·kg-1·h-1,對(duì)照比60μL/L NO處理高23%(p<0.05),但比80μL/L NO處理的乙烯釋放量低28.5%(p<0.05)。由此可知,60μL/L NO處理可以有效的降低伽師瓜在貯藏過程中的乙烯釋放量,但80μL/L NO處理反而有促進(jìn)作用。

圖5 NO處理對(duì)伽師瓜乙烯釋放量的影響Fig.5 Effect of NO on the etbylene production of ‘JiaShi’ Muskmelon

2.6 NO處理對(duì)伽師瓜可滴定酸含量的影響

可滴定酸是決定果蔬風(fēng)味的一個(gè)重要因素。由圖6可知,伽師瓜果實(shí)可滴定酸含量在采后貯藏過程中呈線性下降趨勢(shì)。經(jīng)NO處理的伽師瓜果實(shí)可滴定酸含量均高于對(duì)照,而在整個(gè)貯藏過程中,NO處理濃度為60μL/L的伽師瓜果實(shí)貯藏過程中可滴定酸含量明顯高于對(duì)照和其他處理(p<0.05)。貯藏結(jié)束時(shí),經(jīng)40,60,80μL/L NO處理的伽師瓜和對(duì)照果實(shí)的可滴定酸含量分別是0.048%、0.083%、0.053%和0.059%,60μL/L NO處理的可滴定酸含量顯著高于對(duì)照40.68%(p<0.05)。表明60μL/L NO處理延緩了伽師瓜果實(shí)可滴定酸含量的下降。

圖6 NO處理對(duì)伽師瓜可滴定酸含量的影響Fig.6 Effect of NO on the TA of ‘JiaShi’ Muskmelon

2.7 NO處理對(duì)伽師瓜丙二醛(MDA)含量的影響

由圖7可知,在貯藏過程中,經(jīng)NO處理的果實(shí)丙二醛(MDA)含量均低于對(duì)照果,從第0天起60μL/L NO處理果實(shí)的MDA含量逐漸緩慢增加,到第38d增加到最大值,之后開始下降,但MDA含量顯著低于對(duì)照(p<0.05)。結(jié)果表明,60μL/L NO處理可以有效的保護(hù)果實(shí)細(xì)胞膜的完整性。

圖7 NO處理對(duì)伽師瓜丙二醛含量的影響Fig.7 Effect of NO on the MDA of ‘JiaShi’ Muskmelon

2.8 NO處理對(duì)伽師瓜超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

由圖8可知:伽師瓜在貯藏過程中SOD活性逐漸下降。60μL/L NO處理伽師瓜果實(shí)中SOD的活性明顯高于對(duì)照,差異顯著(p<0.05);40μL/L和80μL/L NO處理伽師瓜果實(shí)中SOD的活性無顯著性差異,但顯著高于對(duì)照(p<0.05),低于60μL/L NO處理果實(shí)(p<0.05)。表明60μL/L NO處理能夠顯著延緩伽師瓜果實(shí)中SOD活性的下降。

圖8 NO處理對(duì)伽師瓜超氧化物歧化酶活性的影響Fig.8 Effect of NO on the SOD activity of ‘JiaShi’ Muskmelon

2.9 NO處理對(duì)伽師瓜過氧化物酶(POD)活性的影響

由圖9可知:伽師瓜果實(shí)在貯藏過程中POD活性呈先增加后降低的趨勢(shì)。對(duì)照果實(shí)的酶活性在貯藏過程逐漸增加,在第38d達(dá)到最大值(0.12437U/g·mf),貯藏后期呈緩慢下降趨勢(shì);40、60、80μL/L NO處理果實(shí)峰值提前7d出現(xiàn),在第31d達(dá)到最大值,最大值分別為0.1222U/g·mf、0.1856U/g·mf、0.1327U/g·mf。結(jié)果表明,60μL/L NO處理可以顯著誘導(dǎo)POD活性的增加(p<0.05)。

圖9 NO處理對(duì)伽師瓜過氧化物酶活性的影響 Fig.9 Effect of NO on the POD activity of ‘JiaShi’ Muskmelon

2.10 NO處理對(duì)伽師瓜過氧化氫酶(CAT)活性的影響

由圖10可知:伽師瓜果實(shí)在貯藏過程中CAT的活性呈先增加后降低的趨勢(shì)。40、80μL/L NO處理果和對(duì)照果的CAT活性在貯藏前期迅速增加,在第21d達(dá)到最大值,之后緩慢下降;而60μL/L NO處理果的CAT活性在整個(gè)貯藏過程中均呈逐漸增加的趨勢(shì),CAT活性顯著高于對(duì)照(p<0.05)。表明60μL/L NO處理能顯著誘導(dǎo)伽師瓜果實(shí)中CAT活性的增加。

圖10 NO處理對(duì)伽師瓜過氧化氫酶活性的影響Fig.10 Effect of NO on the CAT activity of ‘JiaShi’ Muskmelon

3 討論

NO作為一種植物信號(hào)分子,通過抑制植物組織中乙烯生成及其效應(yīng)來延長果蔬的貯藏期并改善果蔬采后貯藏的品質(zhì)。任小林等[18]研究得出適宜濃度的NO處理能夠延緩番茄、獼猴桃、酥梨、蘋果等果實(shí)貯藏期間TSS和TA含量的變化。本實(shí)驗(yàn)研究表明,60μL/L NO處理可顯著減緩果實(shí)TSS含量的下降,處理果的TSS含量在整個(gè)貯藏期間高于對(duì)照,延長伽師瓜的風(fēng)味保持。這可能是由于NO處理抑制了呼吸消耗和多糖物降解受抑所致。

植物在成熟和衰老過程中,內(nèi)源NO含量降低,乙烯含量升高[19]。NO處理可以延緩植物組織的成熟和衰老。新鮮果蔬采收后仍然是活的有機(jī)體,可進(jìn)行各種生理代謝活動(dòng),從而分解和消耗自身的養(yǎng)分,并產(chǎn)生呼吸熱,進(jìn)而使新鮮果蔬發(fā)生變質(zhì)、變味和失水萎焉,甚至腐敗等品質(zhì)劣變問題。大量實(shí)驗(yàn)研究證明,外源NO處理鱷梨、香蕉、獼猴桃等果實(shí),都可提高這些果實(shí)組織中的NO水平,抑制乙烯的產(chǎn)生,延緩乙烯高峰的出現(xiàn),延長果蔬貯藏期[20];EUM等[21]研究發(fā)現(xiàn)NO處理能夠抑制果實(shí)水分的散失,延緩果實(shí)硬度的下降。實(shí)驗(yàn)表明60μL/L NO處理可以延緩伽師瓜果實(shí)失重率的上升,保持果實(shí)水分;對(duì)降低呼吸速率和乙烯釋放速率、保持果實(shí)品質(zhì)和硬度都有較好的效果,延緩果實(shí)衰老。然而80μL/L NO處理加快失重率的上升,促進(jìn)乙烯釋放量的增加。這與Beligni[22]和Jie[23]等研究NO在調(diào)控果蔬的成熟衰老中具有雙重作用,高濃度的NO處理促使組織中活性氧含量增加,最終導(dǎo)致組織衰老的研究結(jié)果一致。

植物在自然衰老狀態(tài)和逆境脅迫時(shí),體內(nèi)的氧代謝就會(huì)失調(diào),活性氧產(chǎn)生加快,清除功能降低,致使活性氧在體內(nèi)聚積,為了保證需氧植物的正常代謝,必須有效地清除由自身代謝或外界不利環(huán)境引起的自由基。大量研究表明,活性氧代謝失調(diào)是導(dǎo)致果實(shí)衰老的重要原因[24-25],對(duì)果蔬采后的品質(zhì)具有重要的影響。SOD、CAT、POD是植物體內(nèi)活性氧自由基的酶促清除體系的主要酶類。NO是生物體內(nèi)的一種調(diào)節(jié)物質(zhì),參與體內(nèi)果蔬多種采后生理代謝過程。張少穎等[26]研究表明NO處理可推遲果實(shí)呼吸和乙烯高峰的出現(xiàn),保持了貯藏后期SOD、CAT、POD較高的活性,延緩了MDA含量和膜相對(duì)透性的升高,延緩了果實(shí)衰老。本實(shí)驗(yàn)研究表明,60μL/L NO處理可以降低伽師瓜果實(shí)MDA的含量;能夠明顯地誘導(dǎo)SOD、POD、CAT活性的增加,增強(qiáng)伽師瓜果實(shí)的抗氧化能力,與徐福樂等[16]研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

通過不同濃度(40、60、80μL/L)NO熏蒸處理對(duì)伽師瓜失重率、果實(shí)硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、呼吸速率、乙烯釋放量、MDA含量和POD、SOD、CAT活性的測(cè)定分析,結(jié)果表明60μL/L NO處理能較好地保持伽師瓜果實(shí)的硬度,延緩失重率的上升;抑制伽師瓜可溶性固形物和可滴定酸含量的下降;抑制果實(shí)的呼吸速率和延緩乙烯釋放量;降低MDA的含量;能誘導(dǎo)SOD、POD、CAT活性的增加,增強(qiáng)果實(shí)的抗氧化能力。但80μL/L NO處理加快失重率的上升,促進(jìn)乙烯釋放量的增加,促使果實(shí)中活性氧含量增加,最終加快果實(shí)的衰老,其衰老機(jī)理需進(jìn)一步深入研究。

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Effect of nitric oxide treatment on postharvest qualityof XinJiang ‘JiaShi’ Muskmelon fruit

HU Jiang-wei1,ZHOU Jiang1,ZHU Xuan1,Atawulla·tiemu2,WU Bin2,*

(1.College of Food Science and Pharmaceutical Science,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China;2.Institute of Agro-products Storage and Processing,Xinjiang Academy of Agricultural Sciences,Urumqi 830091,China)

Effects of nitric oxide treatment on postharvest Physiology of ‘JiaShi’ Muskmelon fruit were investigated in this study. Jiashi Muskmelon were treated with 40,60,80μL/L nitric oxide(NO)fumigation 3h,then stored in cold storage(5±0.5℃)and observed the treatment effect. Changes in these levels of weight-loss rate,firmness of friuts,soluble solids(TSS),titratable acid(TA),respiration rate and ethylene production,superoxide dismutase(SOD),peroxidase activity(POD),catalase(CAT)were measured during storage,in order to screened NO appropriate concentration of Jiashi Muskmelon. The results showed that under the three different of NO concentrations,60μL/L NO treatment could better maintain Jiashi Muskmelon fruits hardness,slow the rise in the rate of weight loss;inhibit the soluble solids,titratable acid content;suppress the respiration rate and ethylene production of fruit;reduce the content of MDA. The 60μL/L NO treatment was able to significantly induce SOD,POD,CAT activity increased,enhance the antioxidant capacity of fruits.

JiaShi melon;Nitric oxide(NO);quality

2014-11-13

胡江偉(1990-)，女，碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。

*通訊作者:吳斌(1973-)，男，博士，副研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題子專題(2011BAD27B01-01-01)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)13-0352-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.065