張帆，李春榮，鄧紅章，張徽，李發(fā)明，張慧慧

(1.旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點實驗室 長安大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710054;2.中國地質(zhì)調(diào)查局水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)調(diào)查中心，河北 保定 071051)

煤轉(zhuǎn)油是解決石油資源短缺的重要途徑，通過該技術(shù)可以將煤炭直接或間接液化［1-2］，最終生產(chǎn)出汽油、柴油或者相關(guān)的石油化工產(chǎn)品，以滿足日益增長的能源需求［3］。但這一過程會產(chǎn)生大量的CO2，如果直接排放將會加重溫室效應(yīng)。為解決煤轉(zhuǎn)油過程中CO2的排放問題，世界各國相繼采用了地質(zhì)封存等手段［4-6］。然而，由于地質(zhì)蓋層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及地震等主觀和客觀因素，可能會造成CO2滲漏，對生態(tài)及人類生存環(huán)境產(chǎn)生不利影響。一般而言，當(dāng)CO2濃度超過39 280 mg/m3，將會嚴(yán)重影響人的呼吸系統(tǒng)，而且長期存在CO2滲漏的陸地表面附近，植物一般很難生長［7］。

目前，有關(guān)CO2濃度升高對土壤微生物群落的影響研究主要集中在大氣CO2濃度升高所產(chǎn)生的影響［8-18］，而且由于供試土壤、供試植物以及實驗方案等的不同，最終所得實驗結(jié)論也不盡相同。與大氣CO2濃度升高相比地質(zhì)封存CO2泄漏入侵土壤包氣帶具有以下特點:①入侵的CO2濃度較高;②由于土壤的相對封蓋作用使CO2處于微壓或超常壓狀態(tài);③CO2入侵方向不同，土壤中CO2由下向上沿垂向濃度逐漸降低，這點與大氣CO2濃度升高引起包氣帶中CO2濃度變化方向相反。所以逃逸CO2入侵包氣帶時，其對植物及土壤微生物所產(chǎn)生的影響更為直接、強度更大。

本文通過原位模擬實驗，研究高濃度CO2入侵包氣帶對土壤微生物量、群落分布及多樣性的影響規(guī)律，從而揭示微生物群落變化與入侵包氣帶CO2濃度之間的相關(guān)性，為地質(zhì)封存CO2泄漏甄別與安全性評價提供理論和技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

選取鄂爾多斯境內(nèi)黃土，土壤基本理化性質(zhì):pH 值8.8，全氮250 mg/kg，全鉀258 mg/kg，有機質(zhì)含量15 mg/kg，水溶性鹽含量283.79 mg/kg;黑麥草;小麥;CO2(鋼瓶氣)。

LDZX-40BI 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器;HH·B11·420-S-II 電熱恒溫培養(yǎng)箱;SW-CJ-1D 單人凈化工作臺;BT 224 S 電子天平;SHA-C 恒溫振蕩器。

1.2 實驗方法

模擬實驗在四間用絕熱材料相互分隔的溫室內(nèi)進行。每間溫室作為一個獨立的實驗區(qū)域，面積24 m2，其中分別埋設(shè)9 個實驗桶;各實驗區(qū)CO2施加 濃 度 依 次 設(shè) 定 為:0，98 210 ，196 430，294 640 mg/m3，分別用CK、01、02 和03 表示;每個實驗區(qū)內(nèi)均設(shè)3 個平行實驗桶和無植被對照實驗桶。

實驗桶由1 cm 厚木板加工成100 cm ×100 cm×100 cm 立方體，埋于地下，上口與地表平齊，桶內(nèi)、外表面用防腐涂料處理。桶底平置環(huán)形氣體分布盤(其材質(zhì)PVC，直徑2 mm，四周鉆有均勻小孔，環(huán)間距8 mm)，分布盤管上鋪墊雙層80 目的樹脂網(wǎng)，氣體分布盤與CO2輸入管相連。桶內(nèi)填充供試土壤，在距地表30 cm 處埋設(shè)土壤氣相CO2濃度監(jiān)測探頭，且每一個實驗桶輸氣口連接一只CO2壓力控制表。充分噴淋潤濕土層，保證土壤含水率20%左右。放置48 h，取土壤樣品測定土壤基本理化性質(zhì)，開起供氣系統(tǒng)，調(diào)節(jié)供氣壓力使各個實驗桶30 cm 埋深處CO2濃度達到設(shè)定濃度要求，繼續(xù)運行至各個實驗桶CO2濃度基本穩(wěn)定。下種，常規(guī)田間管理。模擬實驗于2013 年5 月至2013 年10 月在旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點實驗室、陜西省地下水與生態(tài)環(huán)境工程中心原位試驗場進行。

1.3 分析方法

實驗運行90 d 后，于30 cm 深處用已消毒的取樣鏟取土樣，過1 mm 篩，帶回實驗室進行微生物數(shù)量及DGGE 分析。細(xì)菌選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng);真菌采用馬丁氏培養(yǎng)基培養(yǎng);放線菌采用高氏I 號培養(yǎng)基培養(yǎng)。微生物數(shù)量分析采用CFU 菌落計數(shù)法(活細(xì)胞計數(shù)法);DGGE 分析方法參見文獻［19］。

2 結(jié)果與討論

2.1 CO2 濃度對土壤微生物數(shù)量的影響

無植被(即裸地)實驗桶及有植被實驗桶細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量監(jiān)測結(jié)果見表1、表2。

由表1 可知，裸地實驗桶內(nèi)，隨著CO2濃度的升高，真菌、細(xì)菌和放線菌活菌數(shù)量與對照區(qū)相比均呈減少趨勢，說明土壤CO2濃度的增高對微生物活性產(chǎn)生了一定的抑制作用。

由表2 可知，同一水平CO2處理下，有植被實驗區(qū)土壤真菌、細(xì)菌及放線菌數(shù)量均高于裸地實驗區(qū)。其原因可能是逃逸的CO2可增加其在地表的濃度，從而在加速植物光合作用的同時，促進了植物根際分泌物的產(chǎn)生，使根系生物量、細(xì)根周轉(zhuǎn)、地下可利用碳分配量等增加;根系分泌物的增加勢必會影響根際土壤微生物C、N 源在數(shù)量和結(jié)構(gòu)等方面的改變［20］，因此豐富了微生物可利用營養(yǎng)物，從而促進了微生物的生長［21-22］。表明植物對土壤微生物在高濃度CO2入侵條件下的適應(yīng)性有調(diào)節(jié)作用，可提高其抗逆性。

黑麥草、小麥實驗區(qū)細(xì)菌、放線菌數(shù)量雖然高于相應(yīng)裸地實驗區(qū)，但仍然低于有植被對照區(qū)，表明在高濃度CO2入侵條件下，植物對微生物環(huán)境適應(yīng)性的調(diào)節(jié)能力是有限的。

CO2濃度施加到294 640 mg/m3時，黑麥草實驗區(qū)真菌數(shù)量為3.16 ×104CFU/g 與裸地實驗區(qū)真菌相近;而細(xì)菌、放線菌數(shù)量較裸地實驗區(qū)分別提高了13.22 倍和1.90 倍。表明植物對細(xì)菌抗逆性的調(diào)節(jié)能力最強，其次是放線菌，對真菌抗逆性調(diào)節(jié)能力較弱。原因可能是真菌對C 源利用的條件較細(xì)菌要求高［21］。

在98 210，196 430，294 640 mg/m3處理條件下，放線菌在黑麥草實驗區(qū)的數(shù)量較裸地實驗區(qū)分別提高13.94%，4.91%和90.43%，而小麥實驗區(qū)依次提高19.52%，123.66%和279.90%，表明不同植被對土壤微生物抗逆性調(diào)節(jié)作用差異較大。

表2 有植被實驗區(qū)土壤微生物數(shù)量分析結(jié)果Table 2 Effect of elevated CO2 concentration on soil microbial number in plant test area

2.2 CO2 濃度入侵對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

對CO2施加濃度分別為98 210，196 430，294 640 mg/m3及相應(yīng)對照區(qū)的黑麥草實驗區(qū)(分別用h1、h2、h3 和CK 表示)土壤樣品的16S rDNA V3區(qū)PCR 產(chǎn)物進行DGGE 分析，結(jié)果見圖1。

圖1 黑麥草實驗區(qū)土壤細(xì)菌16S rDNA-DGGE 圖譜Fig.1 16S rDNA-DGGE fingerprint patterns of the soil bacteria in Perennial ryegrass area

由圖1 可知，隨著土壤CO2濃度升高，7，9，23號等條帶亮度變暗，12，20 號等條帶消失，即一些原有物種數(shù)量被大幅度消減或部分物種消失，表明土壤CO2濃度升高對一些土壤細(xì)菌的生長有抑制作用;18，19 號條帶亮度增強，表明隨著土壤CO2濃度增加，一些原有物種數(shù)量較少的細(xì)菌被豐富，土壤CO2濃度升高對另一些土壤細(xì)菌的生長繁殖有刺激作用;當(dāng)土壤CO2濃度達到98 210 mg/m3時，出現(xiàn)了新生條帶(即1，8，10，12，20 號條帶)，表明土壤CO2濃度升高可能會導(dǎo)致某些細(xì)菌的遺傳基因發(fā)生變化或產(chǎn)生新物種;3，4，5，6，11，16，22，24 號條帶具有較高同源性，13，14 及15 號條帶同源且優(yōu)勢，表明土壤CO2濃度的升高對土壤主要建群種無顯著的影響。

各樣品中的細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)、豐度(S)和均勻度(EH)等指標(biāo)進行綜合分析［23］，結(jié)果見表3。

表3 不同實驗區(qū)樣品DGGE 條帶多樣性指數(shù)(H)、豐度(S)及均勻度(EH)Table 3 The diversity index (H)，abundance (S)and evenness (EH)of DGGE strip in different test zone

由表3 可知，98 210 mg/m3黑麥草實驗區(qū)(h1)細(xì)菌多樣性指數(shù)、豐度均高于對照區(qū)(CK);進一步增加CO2濃度，土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)及豐度較對照區(qū)均有所降低;各個實驗區(qū)細(xì)菌均勻度(EH)相同。表明低濃度CO2入侵包氣帶對部分細(xì)菌生長有刺激作用，使其多樣性及豐度有所增加，高濃度CO2入侵使一些土壤細(xì)菌生長受到抑制，其多樣性指數(shù)及豐度顯著降低。

2.3 主要細(xì)菌菌種測序結(jié)果

從每個樣品DGGE 譜圖中選取主要條帶進行克隆測序，得到的部分條帶的16s rDNA 片段測序分析結(jié)果見表4。

由表4 并結(jié)合圖1 可以看出，高濃度CO2入侵時，優(yōu)勢且同源性高的細(xì)菌主要是Catellibacterium(微單狍菌科)、Arthrobacter sp(節(jié)細(xì)菌屬)、Bacteroides sp(擬桿菌屬)。在98 210 mg/m3CO2濃度條件下可能產(chǎn)生的新生細(xì)菌物種主要是Flavobacterium denitrificans(黃桿菌屬)、Haematobacter(紅桿菌屬)、Ferrithrix(熱袍菌門);高濃度CO2能夠促進Pedobacter (地桿菌屬)、Akkermansia(疣微菌門)的生長繁殖，而對unclassified_Betaproteobacteria(β-變形菌屬)、Subdivision3_genera_incertae_sedis 等細(xì)菌的生長繁殖產(chǎn)生明顯抑制作用。細(xì)菌Thauera aminoaromatica(陶厄氏菌屬)及Nitrospira(硝化螺菌屬)等對CO2反應(yīng)敏感，當(dāng)土壤CO2濃度達到196 430 mg/m3時，不能正常生長繁殖，導(dǎo)致該群落消失。

表4 條帶序列菌種鑒定結(jié)果Table 4 Identification results of the bands sequence

當(dāng)土壤CO2濃度不高于294 640 mg/m3時，隨著土壤CO2濃度的增加，土壤細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量均呈減少趨勢。徐國強等［11］發(fā)現(xiàn)，開放式空氣CO2濃度增加，土壤細(xì)菌隨作物生長呈現(xiàn)先減后增的趨勢，但對真菌數(shù)量影響不大。李楊等［15］的研究也有類似的結(jié)果。賈夏等［16］發(fā)現(xiàn)，大氣CO2濃度升高對非根際土壤細(xì)菌有刺激作用，使其數(shù)量增多，而對真菌則表現(xiàn)出抑制作用，同時賈夏等［21］也發(fā)現(xiàn)，大氣CO2濃度升高對根際土壤細(xì)菌、真菌數(shù)量的影響也有類似的結(jié)果。導(dǎo)致不同結(jié)論的原因可能是模擬地層釋放CO2入侵包氣帶的途徑、強度及對土壤微生物的影響機理有別于大氣CO2濃度變化的影響。大氣CO2濃度升高對土壤微生物群落的影響在很大程度上是通過對地表植被的光合作用、生理生化、生長代謝等過程的影響間接表現(xiàn)的，而植被的這些作用過程會因土壤的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)、植物的種類與長勢、水分與養(yǎng)料的供給等因素的變化而變化。地質(zhì)封存CO2泄漏入侵包氣帶，則可以通過對土壤氣相組成、水鹽平衡、可利用無機與有機養(yǎng)分結(jié)構(gòu)形式及土壤結(jié)構(gòu)等的改變對土壤微生物生長產(chǎn)生影響，也可以利用釋放進入大氣中的CO2通過地表植被產(chǎn)生間接影響。與大氣CO2濃度升高對土壤微生物群落影響相比，地質(zhì)封存泄漏的CO2與土壤作用強度更高，諸多因素導(dǎo)致了不同研究條件所得到的結(jié)論有所不同。

另外，在外界環(huán)境脅迫的條件下，植物可以通過自身根際分泌物組成、結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用提高土壤微生物的抗逆性，使其環(huán)境適應(yīng)性顯著增強，這一研究結(jié)果對環(huán)境保護和污染土壤的生物修復(fù)具有一定的指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

(1)高濃度CO2入侵包氣帶，對土壤微生物生長產(chǎn)生一定抑制作用，土壤細(xì)菌多樣性及豐度均降低。

(2)植被可以提高CO2入侵條件下土壤微生物的抗逆性，使其適應(yīng)性顯著增強;不同植被對土壤微生物抗逆性調(diào)節(jié)作用差異顯著，而且與植被的生長周期、根際發(fā)育情況相關(guān)。

(3)同種植被對不同土壤微生物抗逆性調(diào)節(jié)作用差異顯著，對細(xì)菌抗逆性調(diào)節(jié)能力最強，使得低濃度CO2入侵條件下其豐度有所增加。

(4)高濃度CO2入侵包氣帶對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響顯著，但土壤微生物主要建群種未變。

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