憨素連，王福強(qiáng)*，王 晶，劉晨敏

(大連海洋大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

刺參是我國黃渤海海域最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。然而，大規(guī)模、高密度的刺參人工養(yǎng)殖、藥物濫用常常會(huì)導(dǎo)致生態(tài)破壞、水質(zhì)惡化、刺參的疾病和死亡大規(guī)模暴發(fā)等問題。研究表明，在飼料中添加益生菌，除了能增加飼料的適口性和提高養(yǎng)殖動(dòng)物的增重率外，還可以增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力，降低發(fā)病率，是實(shí)現(xiàn)生態(tài)養(yǎng)殖的重要途徑。目前，研究應(yīng)用的益生菌主要有芽孢桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌、酵母菌、霉菌、光合細(xì)菌、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌等。但是，復(fù)合益生菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫和抗力方面的研究較少。胡毅等［1］用復(fù)合益生菌和單一益生菌投喂凡納濱對(duì)蝦，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合組的特定生長(zhǎng)率、飼料效率、溶菌酶活力、血清蛋白濃度等均優(yōu)于單一菌組。筆者對(duì)復(fù)合益生菌對(duì)刺參免疫和抗病力的影響進(jìn)行了研究，旨在為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 復(fù)合益生菌。試驗(yàn)所用的復(fù)合益生菌，由大連陽光白奧科技有限公司生產(chǎn)，由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，106CFU/g以上)、乳酸桿菌(Lactobacilli acidophilus，106CFU/g以上)、酵母菌(Saccharomyces，106CFU/g以上)組成。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)所用刺參來自大連水益生海洋生物科技公司的同一批次刺參苗，刺參購回后暫養(yǎng)馴化1周。挑取個(gè)體大小均勻的健康刺參隨機(jī)分為5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30頭刺參，試驗(yàn)刺參初始體重為(1.07±0.02)g。

1.1.3 試驗(yàn)地點(diǎn)。養(yǎng)殖試驗(yàn)在大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)飼料配方和營養(yǎng)成分見表1～2。分別在基礎(chǔ)飼料中添加 0、0.2%、0.4%、0.6% 和 0.8% 的復(fù)合益生菌，制成A、B、C、D、E 5種飼料。在低于20℃室內(nèi)陰干后貯存于－20℃的冰箱中待用。

1.2.2 飼養(yǎng)管理。每天以刺參體重的3%投餌，根據(jù)攝食情況適當(dāng)調(diào)整飼喂量，達(dá)到飽食投喂。每天17:20投喂1次，次日13:30吸除殘餌和糞便，并補(bǔ)充暫存1 d的沙慮海水。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，水溫控制在(15±3)℃。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)8周。

1.2.3 攻毒試驗(yàn)。攻毒試驗(yàn)使用黃海希瓦氏菌(Shewanella smarisflavi)，為刺參“化皮病”的致病菌之一，菌液由大連海洋大學(xué)病害實(shí)驗(yàn)室免費(fèi)提供。用復(fù)合益生菌養(yǎng)殖刺參8周 后，每頭刺參腹腔注射0.1 ml 6×108CFU/ml的菌液。

表1 試驗(yàn)飼料組成%

表2 試驗(yàn)飼料的營養(yǎng)水平 %

1.2.4 體腔液的采集。分別在攻毒第6天和第10天采集刺參體腔液。每個(gè)水槽中隨機(jī)抽取刺參，用濾紙吸去體表水分后，用無菌、預(yù)冷的手術(shù)剪從刺參腹部近口1/3處剪開腹腔，將體腔液接收到預(yù)冷的離心管中，于4 000 r/min離心15 min，移出上清，分裝到無菌Eppendof離心管中凍存于－20℃冰箱中。每頭刺參取0.5～1.0 ml體腔液，將3～4頭刺參的體腔液混合于1支離心管以消除個(gè)體差異。

1.2.5 免疫指標(biāo)的測(cè)定。體腔液中酸性磷酸酶(ACP)的活性采用磷酸苯二鈉法［2］測(cè)定。堿性磷酸酶(AKP)的活性采用磷酸苯二鈉法測(cè)定［2］。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用鄰苯三酚自氧化法［2］測(cè)定。過氧化氫酶(CAT)的活性采用比色法測(cè)定［2］。溶菌酶(LSZ)活性的測(cè)定參照 Dan等［3］的方法并加以修改:將溶壁微球菌用PBS緩沖液(pH 6.4)溶解，調(diào)整濃度使其在570 nm波長(zhǎng)下吸光值0.2～0.3。測(cè)定組每300μl菌液加入5μl樣液，對(duì)照組以等體積PBS緩沖液代替樣品?；旌虾笤谑覝?18℃)孵育30 min，然后冰浴1 h，測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處的吸光值。LSZ活性單位定義:在37℃以每毫升刺參體腔液樣品每分鐘使吸光度降低0.001為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行，通過ANOVA單因子方差分析和Duncan’s多重檢驗(yàn)分析平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和組間差異顯著性。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌對(duì)刺參免疫酶活性的影響 由表3可知，不同添加量的復(fù)合益生菌對(duì)刺參的AKP和SOD活性無顯著性(P＞0.05)影響;與其它試驗(yàn)組和對(duì)照組相比，0.6%的復(fù)合益生菌顯著提高了刺參的ACP活性(P＜0.05)，0.4%、0.6%和0.8%的復(fù)合益生菌顯著提高了刺參CAT活性(P＜0.05)，而0.6%和0.8%的復(fù)合益生菌則顯著提高了刺參LSZ活性。

表3 復(fù)合益生菌對(duì)刺參免疫酶活性的影響

2.2 復(fù)合益生菌在感染黃海希瓦氏菌前后對(duì)刺參免疫酶活性的影響

2.2.1 對(duì)刺參酸性磷酸酶(ACP)活性的影響。從圖1可以看出，在攻毒前(0 d)，除D組的刺參ACP活性顯著高于其他組外，其他組的ACP活性沒有顯著差異(P＞0.05)。攻毒后各組ACP活性均呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)。攻毒6 d后，E組ACP活性明顯比對(duì)照組低(P＜0.05)。攻毒10 d后，C、D、E組ACP活性均極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。

2.2.2 對(duì)刺參堿性磷酸酶(AKP)活性的影響。從圖2可以看出，攻毒后的所有組的AKP活性均呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。在攻毒前、攻毒6 d和攻毒1 0d后，B、C、D、E組AKP活性均有高于對(duì)照組，但組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2.3 對(duì)刺參超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響。從圖3可以看出，在攻毒后各組的SOD活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低的趨勢(shì)。但在攻毒6 d、10 d后，各試驗(yàn)組的SOD活性的對(duì)照組沒有顯著差異(P＞0.05)，盡管前者較后者有降低的趨勢(shì)。

2.2.4 對(duì)刺參過氧化氫酶(CAT)活性的影響。從圖4可以看出，攻毒后各組刺參的CAT活性有隨時(shí)間延長(zhǎng)而提高的趨勢(shì)。但攻毒前后，B、C、D組CAT活性比對(duì)照組也有增高的趨勢(shì)，但各組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。

圖1 益生菌對(duì)刺參酸性磷酸酶(ACP)活性的影響

圖2 益生菌對(duì)刺參堿性磷酸酶(AKP)活性的影響

圖3 益生菌對(duì)刺參超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

圖4 益生菌對(duì)刺參過氧化氫酶(CAT)活性的影響

2.2.5 對(duì)刺參溶菌酶(LSZ)活性的影響。從圖5可以看出，攻毒前各組LSZ活性隨著益生菌添加量的增加而逐漸升高，其中D、E組LSZ活性顯著高于A組(P＜0.05)。攻毒6 d后，各試驗(yàn)組的LSZ活性均比對(duì)照組增加，但組間差異不顯著(P＞0.05)。攻毒10 d，各組的LSZ活性無顯著差異(P＞0.05)。

3 結(jié)論與討論

圖5 益生菌對(duì)刺參溶菌酶(LSZ)活性的影響

該試驗(yàn)結(jié)果表明在基礎(chǔ)飼料中添加復(fù)合益生菌可以提高刺參的非特性免疫能力，添加量以6 g/kg飼料為宜。該研究為這種復(fù)合益生菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用開辟了廣闊的前景。

3.1 復(fù)合益生菌對(duì)刺參體腔液中免疫酶活性的影響 無脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)并不健全，主要通過非特異性免疫反應(yīng)提供抗感染能力［4］。張艷婷［5］發(fā)現(xiàn)在刺參飼料中添加滅活植物乳桿菌沒有影響刺參的ACP的活性。該試驗(yàn)結(jié)果表明在刺參飼料中添加0.6%的復(fù)合益生菌顯著提高了刺參體腔液的ACP活性，而其他添加量則對(duì)ACP活性沒有顯著影響。這可能與益生菌的種類以及添加量有關(guān)。

一些研究表明飼料中添加益生菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的AKP活性的影響并不一致。袁豐華［6］研究表明在飼料中添加1010CFU/kg凝結(jié)芽孢桿菌或108CFU/kg光合細(xì)菌對(duì)尖吻鱸血液中的AKP活性沒有影響。張艷婷［5］研究表明在飼料中添加高劑量的滅活乳桿菌能夠提高刺參AKP的活性。該研究中添加復(fù)合益生菌沒有顯著增強(qiáng)刺參體腔液中AKP的活性。這表明益生菌對(duì)刺參等水產(chǎn)動(dòng)物AKP的影響既與動(dòng)物的種類有關(guān)，也與益生菌的添加量有關(guān)。

該試驗(yàn)中在飼料中添加復(fù)合益生菌對(duì)刺參體腔液中SOD活性沒有顯著影響。這與袁豐華［6］在尖吻鱸以及張艷婷［5］在刺參上的研究結(jié)果類似，而與王國霞等［7］在凡納濱對(duì)蝦上的研究結(jié)果有所不同。這可能與益生菌的種類和添加量均有關(guān)，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

關(guān)于益生菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物過氧化氫酶(CAT)的影響鮮見報(bào)道。該試驗(yàn)中投喂復(fù)合益生菌組的刺參體腔液中過氧化氫酶活性與對(duì)照組沒有顯著差異。

大量研究表明，益生菌可以提高水生動(dòng)物的溶菌酶水平［5，8］。該研究中在刺參飼料中添加 0.6%和 0.8% 的復(fù)合益生菌可以顯著提高刺參體腔液中的LSZ活性，這與上述研究結(jié)果基本一致。

3.2 復(fù)合益生菌對(duì)希瓦氏菌攻毒的刺參體腔液中免疫酶活性的影響 “化皮病”是目前流行最嚴(yán)重的、常導(dǎo)致刺參大量死亡的疾病，而黃海希瓦氏菌是引起大連地區(qū)刺參化皮病的重要病原菌［9］，這也是該試驗(yàn)中采用希瓦氏菌對(duì)刺參攻毒的重要原因。

該試驗(yàn)中攻毒6 d后，各組ACP活性均有所下降，添加0.8%益生菌的處理組ACP活性比對(duì)照組低。在攻毒10 d后，ACP活性恢復(fù)到攻毒前的水平，但添加高劑量益生菌組的刺參ACP水平也均比對(duì)照組顯著降低。這表明高劑量益生菌會(huì)抑制刺參體腔液中ACP的活性。這與張艷婷［5］的結(jié)果并不一致，其原因有待進(jìn)一步探討。

該試驗(yàn)中攻毒后刺參體腔液AKP活性也發(fā)生變化。攻毒后的所有組的AKP活性均呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。在攻毒前、攻毒6 d和攻毒10 d后，B、C、D、E組AKP活性均有高于對(duì)照的組。劉洪展［10］用假交替單胞菌感染仿刺參，在5 d內(nèi)體腔液AKP活性逐漸降低，此后急劇上升，與該試驗(yàn)攻毒后的酶活性變化趨勢(shì)相似。

該試驗(yàn)中在攻毒后各組的SOD活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而呈降低的趨勢(shì)。但在攻毒6 d、10 d后，各試驗(yàn)組的SOD活性較對(duì)照組沒有顯著差異，這與張艷婷［5］的結(jié)果類似。張艷婷［5］研究表明添加滅活植物乳桿菌對(duì)攻毒后的刺參SOD活性無影響。

該試驗(yàn)中人工感染黃海希瓦氏菌后，刺參體腔液CAT活性在第6天與攻毒前沒有太大變化，而在第10天整體增強(qiáng)，且益生菌組有高于對(duì)照組的趨勢(shì)。這說明致病菌感染激發(fā)了刺參CAT的活性，且益生菌對(duì)刺參過氧化氫酶活性有促進(jìn)作用。

該試驗(yàn)中投喂復(fù)合益生菌能顯著刺參體腔液中LSZ的活力。攻毒6 d、1 0d后，各試驗(yàn)組LSZ活性沒有顯著差異，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)而呈降低的趨勢(shì)。李明［11］分別用梅奇酵母和芽孢桿菌投喂刺參，發(fā)現(xiàn)在第3、4周試驗(yàn)組的刺參體腔上清液溶菌酶活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，與該試驗(yàn)結(jié)果相似。在感染黃海希瓦氏菌后，溶菌酶活性較攻毒前整體下降。這說明體腔液中溶菌酶的活性比較容易受到致病菌感染的抑制，免疫功能容易遭到破壞。攻毒6 d后，益生菌組的溶菌酶活性仍高于對(duì)照組，說明益生菌能夠適當(dāng)減少這種損害，使酶活性在相對(duì)較高的水平。劉洪展［10］用假交替單胞菌感染仿刺參后，體腔液溶菌酶的活力在短暫升高后顯著降低，與該試驗(yàn)結(jié)果相一致。

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