李 廷，徐 濤，張延輝，劉春雷

（1.青島市婦女兒童醫(yī)院，山東266000；2.青島市中心醫(yī)院，山東266000）

G250mAb 修飾的腫瘤細(xì)胞靶向基因載體功能研究

李 廷1，徐 濤2，張延輝2，劉春雷2

（1.青島市婦女兒童醫(yī)院，山東266000；2.青島市中心醫(yī)院，山東266000）

目的分析G250mAb與聚乙烯亞胺（PEI）偶聯(lián)作為腫瘤靶向基因載體系統(tǒng)的優(yōu)越性，為腫瘤細(xì)胞靶向基因治療提供研究基礎(chǔ)。方法通過二硫鍵將G250mAb與PEI偶聯(lián)，得到修飾后的基因載體G250mAb-PEI，利用體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法研究其轉(zhuǎn)基因的優(yōu)越性。結(jié)果G250mAb-PEI轉(zhuǎn)染效率明顯高于單純PEI或傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；其毒性也較未修飾的PEI低；對人宮頸癌細(xì)胞Hela的基因轉(zhuǎn)染具有顯著的靶向性，其轉(zhuǎn)基因效率是肝癌細(xì)胞HepG2（G250陰性）的2倍，而對正常血管平滑肌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率較Hela低近20倍。結(jié)論G250mAb-PEI是一種高效、低毒和具有靶向性的基因載體。

Hela細(xì)胞； 聚乙烯亞胺； 遺傳載體； 腫瘤/病理學(xué)； 基因； 轉(zhuǎn)染； G250mAb

基因治療的發(fā)展出現(xiàn)障礙，最主要的問題是如何有效地將基因釋放到靶細(xì)胞中長期穩(wěn)定地表達，同時較少產(chǎn)生不良反應(yīng)，即載體效率、靶向性和安全性[1]。高分子基因傳遞系統(tǒng)曾取得較大進展，結(jié)構(gòu)簡單的高分子很難使DNA穿越細(xì)胞內(nèi)的所有屏障，設(shè)計多成分、多性能載體將是高分子基因治療的研究方向[2]。單克隆抗體用于提高腫瘤治療的靶向性具有重要意義。自創(chuàng)立單克隆抗體制備技術(shù)以來，單克隆抗體的研制與應(yīng)用使靶向藥物迅速發(fā)展[3-4]，對腫瘤靶向治療具有重要意義。目前研制的抗腫瘤靶向藥物大部分屬于單抗制品或以單抗為靶向載體的免疫偶聯(lián)物，其中，單克隆抗體與靶細(xì)胞行抗原-抗體特異性結(jié)合，使藥物或放射性核素釋放的射線損傷與抗體結(jié)合的靶細(xì)胞DNA，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。目前單抗在腫瘤的靶向治療領(lǐng)域有著重要的地位[6]。G250是膜相關(guān)性的碳酸酐酶，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。腎癌G250抗原有良好的腫瘤特異性，其在腎癌細(xì)胞中的特異表達使其成為腎癌診斷和治療的重要靶位。本文將G250mAb與聚乙烯亞胺（PEI）偶聯(lián)，選用人宮頸癌細(xì)胞Hela（G250陽性）和人肝癌細(xì)胞HepG2、大鼠平滑肌細(xì)胞（SMC，G250陰性），利用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，檢測G250mAb修飾的PEI對Hela細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的靶向性。

1 材料與方法

1.1 材料 PEI枝化型（相對分子質(zhì)量為25 000）、N-琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫）丙酸酯（SPDP）和2-咪唑硫烷均來自美國Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑盒（LipofectamineTM2000）來自美國Invitrogen公司；小鼠成纖維細(xì)胞（NIH3T3，武漢大學(xué)）；人宮頸癌細(xì)胞Hela、人肝癌細(xì)胞HepG2（本實驗室保存）；大鼠平滑肌細(xì)胞SMC；噻唑藍（MTT，生化純，Gibco公司）；二甲亞砜（DMSO，分析純，天津市化學(xué)試劑三廠）；DMEM（美國Gibco公司）；倒置熒光顯微鏡（Nikon ECLIPSE TE2000U，日本）；酶標(biāo)儀（Labsystem，Muhiskan，Ascent，芬蘭）。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒擴增和純化 質(zhì)粒pEGFP-C1在大腸桿菌中擴增，使用Qiagen plasmid Maxiprep試劑盒按照產(chǎn)品操作說明分離、提取和純化質(zhì)粒。利用凝膠電泳和紫外-可見分光光度計（UA）檢驗并測定所提取的質(zhì)粒DNA的純度和濃度，然后將DNA在TE緩沖溶液（含0.1mol/L氯化鈉、0.01 mol/L三羥甲基氨基甲烷，pH=8.0）中稀釋，于-20℃保存。

1.2.2 G250mAb與PEI復(fù)合物的合成 向5 mL PEI的磷酸鹽緩沖液（PBS，濃度5 mg/mL）中加入20 μL的SPDP（10 mmol/L DMSO溶液），混合物在室溫下避光反應(yīng)30 min，加入100 μL 1 mol/L的甘氨酸溶液終止反應(yīng)。在室溫下G250mAb溶于1 mL冷PBS，然后加入21.8μL 20 mol/L的2-咪唑硫烷活化，混合物在室溫下避光反應(yīng)30 min，加入50 μL 1 mol/L的甘氨酸溶液終止反應(yīng)，然后與活化的PEI混合，在室溫下繼續(xù)反應(yīng)1 h，將最終產(chǎn)物用Sephadex G-75分離純化，收集產(chǎn)物用蒸餾水透析，冷凍干燥后得到G250mAb-PEI靶向載體。

1.2.3 體外轉(zhuǎn)染試驗篩選轉(zhuǎn)染G250陽性細(xì)胞Hela效率最佳的產(chǎn)物 G250mAb與PEI之間的質(zhì)量比例影響著二者偶聯(lián)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染率，通過體外轉(zhuǎn)染試驗篩選轉(zhuǎn)染G250陽性細(xì)胞Hela效率最佳的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)染前24 h在24孔培養(yǎng)板中種入Hela細(xì)胞，密度約為每孔20 000個細(xì)胞，G250mAb-PEI（1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600）與DNA以不同的質(zhì)量比轉(zhuǎn)染G250陽性細(xì)胞Hela，48 h后在熒光顯微鏡下觀察蛋白表達情況。

1.2.4 基因載體轉(zhuǎn)染效率測定 選擇Hela和HepG22種常見腫瘤細(xì)胞，前者表達G250，而后者不表達G250。用正常細(xì)胞SMC作為對照組。轉(zhuǎn)染前24 h在24孔培養(yǎng)板中分別種入HepG2、Hela細(xì)胞，密度約為每孔20 000個細(xì)胞。每孔加入0.5 mL完全DMEM培養(yǎng)基，5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前先移去完全培養(yǎng)基，用溫?zé)酨BS洗滌細(xì)胞。用0.5 mL無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在溫和渦旋攪拌下，G250mAb-PEI與DNA以質(zhì)量比3∶1混合，PEI與DNA以質(zhì)量比1∶1混合，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000與DNA以3∶1混合，孵育30 min，將復(fù)合物溶液均勻地加入到各孔中，37℃轉(zhuǎn)染4～6 h后將無血清培養(yǎng)基換成0.5 mL完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在倒置熒光顯微鏡下觀測轉(zhuǎn)染結(jié)果。同時，Hela/ SMC：Hela/HepG2培養(yǎng)后行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 基因載體的細(xì)胞毒性測定 將NIH3T3細(xì)胞接種到96孔板（1×104/孔），培養(yǎng)24 h后每孔分別加入G250mAb-PEI/PEI/Lipofectamine，使終濃度分別為20、40、60、80、120、160 μg/mL，對照組不加基因載體。培養(yǎng)24 h后每孔加入25 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，用PBS清洗1次，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm波長下測定吸光度。每個濃度及對照組做6個平行樣，實驗重復(fù)3次。根據(jù)下列公式計算細(xì)胞的相對成活率：相對成活率=樣品組平均吸光度值/對照組平均吸光度值×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 G250mAb與PEI復(fù)合物的合成 G250mAb與PEI的反應(yīng)為PEI過量反應(yīng)，反應(yīng)體系中除G250mAb-PEI外，還有過量的PEI和化學(xué)小分子。根據(jù)其相對分子質(zhì)量大小的不同，利用分子篩原理進行SephadexG-75分離純化，見圖1。

圖1 G250mAb與PEI復(fù)合物合成分離純化

2.2 通過體外轉(zhuǎn)染試驗篩選轉(zhuǎn)染G250陽性細(xì)胞Hela效率的最佳產(chǎn)物 G250mAb對PEI的不同修飾度影響載體對Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，其中G250mAb-PEI（1∶400）轉(zhuǎn)染效率最高，其他比例的產(chǎn)物較之均偏低。經(jīng)過篩選得到G250mAb-PEI 1∶400在該實驗合成比例中為最佳載體，見圖2。

圖2 G250mAb-PEI轉(zhuǎn)染效率熒光照片（100×）

2.3 基因載體轉(zhuǎn)染效率測定 G250修飾的PEI對Hela細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染具有靶向性。G250mAb-PEI對Hela/SMC和Hela/HepG2的轉(zhuǎn)染率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3、4。

圖3 體外轉(zhuǎn)染Hela、HepG2、SMC細(xì)胞熒光照片（100×）

圖4 共培養(yǎng)的Hela/SMC、Hela/HepG2細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

2.4 基因載體的細(xì)胞毒性測定 G250mAb修飾后載體的生物相容性顯著提高，對NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性顯著低于PEI、Lipofectamine，見圖5。

圖5 G250mAb-PEI轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞毒性MTT分析

3 討 論

病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但缺點是安全性較差，且其免疫原性高，所以在體內(nèi)應(yīng)用不廣。而非病毒載體安全性較高，免疫原性也較低，將成為首選的基因轉(zhuǎn)染載體[7]。PEI還可以合成更復(fù)雜的DNA非病毒載體釋放系統(tǒng)，用于體內(nèi)基因治療。Koo等[8]發(fā)現(xiàn)，PEI能轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞基因，但能引起紅細(xì)胞聚集和溶血，使體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率大大降低[9]。PEI作為基因載體的缺點還包括高毒性和不可降解性，可以通過PEG、脂質(zhì)體或細(xì)胞特異配體等方法把PEI/DNA復(fù)合物屏蔽，從而降低PEI的細(xì)胞膜毒性，增強載體的靶向性。G250mAb通過二硫鍵將PEI與G250mAb偶聯(lián)，可以特異性結(jié)合原發(fā)性腎癌和轉(zhuǎn)移性腎癌、宮頸癌、卵巢癌、食管癌等表面的G250抗原[10]，從而合成G250mAb-PEI基因載體。既實現(xiàn)了用細(xì)胞特異性配體降低PEI的細(xì)胞膜毒性，又增強了G250mAb與PEI的協(xié)同靶向性。本實驗證明，G250mAb-PEI對Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率是SMC轉(zhuǎn)染效率的19倍。對于Hela細(xì)胞，G250mAb-PEI的轉(zhuǎn)染效率較未修飾的PEI高1倍，而對SMC的轉(zhuǎn)染效率二者差別不大。結(jié)果表明，G250mAb-PEI/DNA復(fù)合物能夠與G250抗原緊密結(jié)合，促進細(xì)胞胞吞，使轉(zhuǎn)染效率得到提高。相關(guān)文獻報道，PEI與NIH3T3細(xì)胞作用24h后，根據(jù)MTT試驗計算生存率，PEI濃度為6 μg/mL時，細(xì)胞生存率為64.2%，在相同的條件下，G250mAb-PEI細(xì)胞生存率為82.0%，當(dāng)其濃度大于6μg/mL時，PEI轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生存率急劇下降，在25 μg/mL時降到10%左右，而G250mAb-PEI濃度在6～25 μg/mL時細(xì)胞生存率保持在60%～80%，為G250mAb-PEI在體內(nèi)實驗中的應(yīng)用提供了廣闊的空間[11]。證明G250mAb-PEI是一種毒性低、效率高、靶向性強的基因載體，為腫瘤細(xì)胞靶向基因治療提供了一個很好的轉(zhuǎn)染途徑。針對PEI的細(xì)胞毒性，近年來也有學(xué)者利用PEG和細(xì)胞特異性配體共同修飾PEI[12-13]，例如G250mAb、PEG共同修飾載體后，細(xì)胞毒性降低，生物相容性提高，對NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性顯著低于PEI，使PEI的高毒性和不可降解性大大降低。

綜述所述，G250mAb-PEI是一種高效、低毒且具有靶向性的基因載體。

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Study on vector function of G250 mAb modified tumor cell target gene

Li Ting，Xu Tao，Zhang Yanhui，Liu Chunlei
（1.Qingdao Municipal Women and Children Hospital，Qingdao，Shandong 266000，China；2.Qingdao Municipal Central Hospital，Qingdao，Shandong 266000，China）

ObjectiveTo research and analyze the superiority of G250mAb coupling with polyethyleneimine（PEI）as a tumor-targeted gene vector to lay the foundation for targeted gene therapy of tumor cells.MethodsG250mAb was coupled with PEI by the disulfide bond for obtaining the modified gene vector G250mAb-PEI.The transfected cells in vitro method was applied to study its transgenetic superiority.ResultsThe transfection efficiency of G250mAb-PEI was significantly higher than that of pure PEI or traditional lipofectamine trasfection；its toxicity was lower than that of non-modified PEI；the gene transfection of cervical cancer Hela cells had significant targeting and its transfection efficiency was twice that of liver cancer cells HepG2（G250 negative），but the transfection efficiency of normal vascular smooth muscle cells（SMC）was lower than that of Hela by nearly 20-fold.ConclusionG250mAb-PEI is a highly efficient gene vector with low cytotoxicity and targeting effect.

Hela cell； Polyethyleneimine； Genetic vectors； Neoplasms/pathology； Genes； Transfection；G250mAb

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.12.002

:A

:1009-5519（2015）12-1764-03

2015-02-08）

青島市衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（WSZD080）。

李廷（1981-），女，山東青島人，碩士研究生，主要從事腫瘤的診斷及治療工作；E-mail：qingdaoliting@163.com。

劉春雷（E-mail：qdzxyymnwk@163.com）。