李成林 江會鎮(zhèn) 陳博靈 盧健琪 潘朝鋅 王慶高

湖北中醫(yī)藥大學(武漢 430000)

扶芳藤益心方對缺氧/復氧后人心內膜微血管內皮細胞的增殖作用

李成林 江會鎮(zhèn)△陳博靈▲盧健琪▲潘朝鋅▲王慶高▲

湖北中醫(yī)藥大學(武漢 430000)

目的：研究扶芳藤益心方對缺氧/復氧后人心內膜微血管內皮細胞(HUMCE)增殖的影響。方法：取體外培養(yǎng)的第4代HUMCE分為造模組：扶芳藤益心方組(FY)、益心方組(Y)、卡托普利高、中、低濃度組(10-2μmol/L、10-3μmol/L、10-4μmol/L)、對照組(H/R)和非造模組(N)。造模組行缺氧/復氧(H/R)處理，非造模組不做缺氧/復氧處理,兩組均添加相應的含藥血清干預培養(yǎng)24h后，通過MTT法測定各組OD值，流式細胞儀檢測細胞Caspase-3陽性細胞數，酶聯免疫法(ELISA)檢測各組血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2)、血管內皮生長因子(VEGF)的含量。結果：與造模組比較，非造模組OD值大(P<0.05)，VEGFR-2、VEGF含量與Caspase-3陽性細胞數均高于造模組(P<0.05)。與對照組比較，扶芳藤益心方組OD值高(P<0.05)；Caspase-3陽性細胞數升高9.87%(P<0.05)；VEGFR-2、VEGF濃度升高(P<0.05)。與扶芳藤益心方組比較，益心方組、卡托普利中、低劑量組OD值低，卡托普利高劑量組OD值高(P<0.05)；卡托普利低劑量組VEGFR-2、VEGF濃度低(P<0.05)，卡托普利高、中劑量組均高于扶芳藤益心方組(P<0.05)；益心方組、卡托普利中、低劑量組Caspase-3陽性細胞數分別較扶芳藤益心方組降低6.77%、2.49%、5.7%，卡托普利高劑量組升高4.39%(P<0.05)。結論：扶芳藤益心方可以提高內皮細胞在缺氧/復氧后的增殖活性，降低內皮細胞的凋亡率，優(yōu)于益心方組、卡托普利低、中劑量組，且提高缺氧/復氧損傷后內皮細胞VEGFR-2、VEGF濃度，優(yōu)于卡托普利低濃度組和益心方組，改善內皮功能。

血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor VEGF)是目前已知的作用最強的促血管生成因子。生理情況下，VEGF及其受體的表達水平均很低，只有在內皮細胞受損時才會有增殖效應。缺血缺氧是VEGF最強有力的調控因素。VEGFR主要分布于血管內皮細胞。缺氧對受體表達也起重要調節(jié)作用。Waltenberger發(fā)現，缺氧時人臍靜脈內皮細胞中VEGFR-2水平上升,而VEGFR-2mRNA仍保持穩(wěn)定甚至有所下降。研究發(fā)現，無論在生理還是在病理情況下，均能促進新生血管的形成，調節(jié)血管生成的大多數環(huán)節(jié)，包括內皮細胞外基質溶解、內皮細胞遷移、增生和管腔形成、增加細胞間黏附和血管細胞黏附分子水平及誘導內皮細胞上相應的配體和受體的表達等。血管內皮細胞的損傷是心血管性疾病的關鍵環(huán)節(jié)[1]，心臟缺血再灌注過程中最先波及的基本部位也是最關鍵的部位是心內膜微血管內皮細胞[2]，它是諸多毒素、病毒、炎癥因子等的重要靶位，該部位的變化對各組織、器官的損傷和功能的恢復影響巨大[3-5]。壯醫(yī)認為，心內膜微血管內皮細胞損害可歸屬于壯醫(yī)“龍路病”范疇，人體氣血虛弱的基礎上，邪毒滯留龍路，使局部的“龍路”網絡瘀阻不暢，終致道路不通、天地人三部之氣不能同步運行、氣血瘀滯而發(fā)病。治療當以補虛、通龍路、祛瘀為大法。根據壯醫(yī)組方理論，針對補虛、通路、祛瘀治法，需投以公藥進行組方。筆者自擬以扶芳藤為君、人參和三七為臣、石菖蒲為佐使的扶芳藤益心方及去扶芳藤的益心方(以下簡稱益心方)，觀察試驗中對缺氧/復氧后人心內膜微血管內皮細胞的影響，現將研究結果報道如下。

1 材料和方法 1.1 試 劑 MTT試劑盒(Sigma公司)，卡托普利純粉(上海遠慕生物科技有限公司提供，批號：K0164)，VEGFR、VEGF試劑盒(武漢華美，批號：Y19012415，Y05012414)，一抗：Rabbit Anti-active-Caspase-3 antibody (ab4051)同型對照：兔IgG (碧云天A7016)，二抗：FITC標記的山羊抗兔二抗(ab6717)。

1.2 主要儀器與動物 酶標儀(BioTek公司)，Millpore Guava 6HT 流式細胞儀，Eppendorf冷凍離心機，紫外分光光度計(天津，型號：UV-1800)，SD大鼠，SPF級，180～220g，雌雄各半(廣西醫(yī)科大學動物實驗中心)，原代人心內膜微血管內皮細胞、原代內皮細胞特制培養(yǎng)體系(武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司，HUM-CELL-0017，)，扶芳藤益心方醇提膏、益心方醇提膏(廣西中醫(yī)藥大學制藥廠提取，藥材紅參、三七、石菖蒲由南寧市景昌中藥飲片有限公司提供，扶芳藤由廣西中醫(yī)藥大學制藥廠提供)。

1.3 制備含藥血清 12只SD大鼠分為扶芳藤益心方組(FY)、益心方組(Y)和空白組，每組4只大鼠，雌雄各半。按所需濃度稱取卡托普利純粉溶解在大鼠血清中制備卡托普利藥物血清。根據表1，配成藥液，4℃保存。FY組、Y組大鼠以20mL/Kg藥液濃度灌胃，空白組以20mL/Kg的蒸餾水灌胃，連續(xù)3d，1d2次。第3d最后1次給藥1h后，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置2h后，3000r/min離心分離血清，56℃水浴滅活，0.22μm無菌濾器過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 扶芳藤益心方及益心方藥液配置

注：人用劑量這里扶芳藤益心方以臨床日用劑量58g生藥/人/次；益心方為28g生藥/人/次

1.4 試驗分組與H/R模型造模 按照說明書用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng) HUMCE。取第3代HUMCE隨機分為非造模組(N)和造模組：對照組(H/R)、卡托普利組(高(CAP1)、中(CAP2)、低(CAP3))、扶芳藤益心方組(FY)、益心方組(Y))。造模組細胞，預先用純氮氣飽和DMEM培養(yǎng)基10min，并充入純氮氣排凈培養(yǎng)瓶中氧氣后，密封置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中2h后，換未經處理的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。N組在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)同等時間。

1.5 MTT法 調整非造模組與造模組HUMCE密度至每孔3×104/mL，按實驗分組接種到96孔培養(yǎng)板中，且每組3個復孔。待細胞貼壁后棄各組細胞上液，FY、Y、CAP1、CAP2、CAP3各組均加入100μL相應的含藥血清，N、H/R組另加入100μL空白大鼠血清，將各組均放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)12h后，向每孔中加入10μLMTT溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育4h，棄上液，每孔加入150μLDMSO，在搖床上低速振蕩10min。用酶標儀測定在490nm處吸光值OD。

1.6 流式細胞儀檢測 檢測細胞Caspase-3陽性細胞數及平均熒光強度 收集各組實驗干預后細胞并進行細胞計數，制備1×105/100μL細胞懸液，加入100μL 4%多聚甲醛4℃放置15mins,PBS洗細胞4次，每次400g,5min,100μL 0.1%Triton 4℃放置5min，PBS洗細胞4次，每次400g,5min,100μL Anti-Caspase-3 antibody(1∶100比例稀釋)或兔IgG(1∶100比例稀釋)，4℃放置30min，PBS洗細胞4次，每次400g,5min,100μFITC標記的山羊抗兔二抗(1∶100比例稀釋)，4℃放置30min，PBS洗細胞4次，每次400g,5min，加入200μ的PBS，上機進行檢測。

1.7 ELISA法檢測 檢測VEGFR-2、VEGF濃度:取試驗處理后各組細胞上液，按ELISA試劑盒說明操作。

2 統(tǒng)計學方法 本實驗所測得結果為計量資料表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理，兩組均數比較采用t檢驗，組間單因素比較采用方差分析，P<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計學意義。

3 結 果 3.1 對H/R后HUMCE增殖和凋亡的的影響

表2 MTT法檢測各組細胞在490nm波長吸光值(OD值)統(tǒng)計結果(±s)

注：與非造模組比較，▲(P<0.05)；與扶芳藤益心方組比較，△(P<0.05)；與益心方組比較，□(P<0.05)

如表2所示，缺氧/復氧降低HUMCE的增殖活性且顯著降低,扶芳藤益心方對H/R后HUMCE具有明顯增殖作用和抑制凋亡的作用。

3.2 扶芳藤益心方對Caspase-3陽性細胞數及平均熒光強度影響 圖1所示，扶芳藤益心方可提高H/R后HUMCE的增殖活性，且優(yōu)于益心方組，卡托普利中、低劑量組(P<0.05)。 與扶芳藤益心方組比較，益心方組，卡托普利中、低劑量組Caspase-3陽性細胞數分別較扶芳藤益心方組降低6.77%、2.49%、5.7%，卡托普利高劑量組升高4.39%(P<0.05)。

3.3 扶芳藤益心方對VEGFR-2、VEGF濃度的影響

表3 ELISA試劑盒檢測各組細胞VEGFR-2、VEGF濃度統(tǒng)計結果(±s)

注：與非造模比較，▲P<0.05；與FY比較，△P<0.05；與Y組比較，對照組P<0.05

表3所示，扶芳藤益心方可以提高H/R損傷后HUMCE的VEGFR-2、VEGF濃度，且優(yōu)于益心方組、卡托普利低劑量組(P<0.05)，但低于卡托普利高、中劑量組(P<0.05)。

圖1 流式細胞儀檢測各組Caspase-3陽性細胞數用散點圖表示，右上角表示陽性細胞的百分 IgG

4 討 論 《素問》:“血氣不和,百病乃變化而生”，“血能載氣，氣能行血”。壯醫(yī)認為：“疾患并非無中生，乃系氣血不均衡”。心內膜微血管內皮細胞缺血損傷大多由高血壓病、冠心病等疾病所致，中醫(yī)可以歸納為“胸痹”、“心悸”、“怔忡”等范疇，壯醫(yī)可以歸納為“龍路病”，中醫(yī)和壯醫(yī)均認為由氣血不調所致，以益氣活血通絡為治療原則。扶芳藤益心方中，扶芳藤、人參、三七、石菖蒲均為公藥，其中扶芳藤是特色壯藥，《中國壯醫(yī)學》載：“扶芳藤，辛、平，能通火路、龍路，舒筋脈，止出血，散瘀血，補虛”，具有補虛、活血止血、通脈絡的扶芳藤在方中為主藥;人參擅長補氣、三七擅長祛瘀，二藥共為幫藥，協(xié)助主藥，增強主藥的作用?！吨袊鴫厌t(yī)學》載：“三七，甘、微苦、溫，具有止血，除瘀血，通龍路，消腫，止疼痛”。《廣西本草選編》載：“石菖蒲，化痰開竅，化濕和胃，醒神益智，可溫通龍路?！笨v觀全方，公藥、主藥、幫藥、帶藥合用，符合壯醫(yī)理論的組方原則。根據中醫(yī)理論及理法方藥原則，要遵循君臣佐使進行組方，該扶芳藤益心方中，以扶芳藤為君，人參、三七為臣，石菖蒲為佐使藥。故本方既符合中醫(yī)組方原則，又符合壯醫(yī)理論的組方原則，四藥合用，更大地發(fā)揮益氣活血通絡之功。

本實驗研究發(fā)現，表2、圖1結果顯示，扶芳藤益心方可以顯著改善H/R后內皮細胞的增殖活性，且較益心方，卡托普利低劑量組效果明顯；扶芳藤益心方還能提高內皮細胞Caspase-3陽性細胞數，分別較益心方、卡托普利中、低劑量提高6.77%、2.49%、5.7%。表3結果顯示，扶芳藤益心方通過提高H/R后內皮細胞VEGFR-2、VEGF濃度，促使內皮細胞增殖及血管重建，從而維持微血管內皮的完整性及功能，且優(yōu)于益心方與卡托普利低劑量組。綜上所述具有益氣活血通絡功效的扶芳藤益心方能夠改善心內膜微血管內皮細胞增殖活性及內皮功能，而且效果均優(yōu)于益心方和卡托普利中、低劑量組，為將扶芳藤益心方開發(fā)為改善缺氧/復氧損傷后心內膜微血管內皮細胞增殖藥物提供了理論依據。

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(收稿2014-12-19；修回2015-01-18)

微血管 內皮細胞 動物實驗 大鼠 @扶芳藤益心方

R29

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.05.047

△廣西中醫(yī)藥大學 (南寧 530001)

▲廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 ( 南寧 530023)