潘興華，龐榮清，蔡學(xué)敏，阮光萍，朱光旭，楊建勇

干細(xì)胞治療技術(shù)研究與實(shí)踐

潘興華，龐榮清，蔡學(xué)敏，阮光萍，朱光旭，楊建勇

干細(xì)胞；治療；技術(shù)；實(shí)踐

利用干細(xì)胞(stem cell,SC)的自我更新和多向分化特性來治療損傷、退變性疾病是醫(yī)學(xué)發(fā)展的新方向。SC可來源于早期胚胎和成體組織，還可通過體細(xì)胞核移植、基因?qū)爰吧锘钚砸蜃诱T導(dǎo)等方式獲得[1]。不同來源的干細(xì)胞具有共同的生物特性，但在分化潛能上有一定差異。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)具有強(qiáng)大的可塑性，但涉及臨床應(yīng)用尚存在倫理、安全及技術(shù)問題。人工誘導(dǎo)獲得的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)具有ESC的基本特性，應(yīng)用前景最好，但還有諸多技術(shù)問題需要解決。與之相比，來源于成體組織的干細(xì)胞(adult stem cell，ASC)分化潛能相對有限，但可以實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，避免ESC的弊端，具有臨床應(yīng)用優(yōu)勢。來源于骨髓、臍帶等組織的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)具有跨胚層分化潛能，體外生長速度快，易于大規(guī)模和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，其優(yōu)勢是免疫原性低，異體移植治療無明顯排斥反應(yīng)，可能在臨床優(yōu)先應(yīng)用[2]。SC治療具有多重生物效應(yīng)，對戰(zhàn)創(chuàng)傷、衰老退變、細(xì)胞變性壞死及自身免疫等疾病治療具有藥物難以替代的作用。

1 干細(xì)胞治療技術(shù)研究的目標(biāo)

本課題組的總體目標(biāo)是緊扣國內(nèi)外SC技術(shù)發(fā)展趨勢，結(jié)合臨床重大疾病治療和軍事醫(yī)學(xué)發(fā)展需求，圍繞解決SC臨床應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)問題開展集成研究，建立SC制備、儲(chǔ)存及轉(zhuǎn)化應(yīng)用技術(shù)體系，積極而規(guī)范地推進(jìn)SC技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。重點(diǎn)是針對SC治療技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用所涉及的關(guān)鍵技術(shù)問題，建立SC采集、制備、鑒定、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和質(zhì)量控制技術(shù)體系及規(guī)范，通過人類疾病動(dòng)物模型治療實(shí)驗(yàn)，解決臨床療效、安全性、機(jī)制等問題，研究建立可供臨床參照的技術(shù)方案。具體方案是針對臨床治療和軍事醫(yī)學(xué)需要，提出擬解決的關(guān)鍵技術(shù)問題，通過申請科技基金的方式把問題變成項(xiàng)目，通過項(xiàng)目實(shí)施形成技術(shù)成果，最后把成果轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床。長期目標(biāo)是系統(tǒng)性、集成化研究SC應(yīng)用技術(shù)，持續(xù)創(chuàng)制新型SC產(chǎn)品并建立SC資源庫，按照SC技術(shù)臨床準(zhǔn)入要求開展臨床前研究，積極規(guī)范地推進(jìn)SC治療新技術(shù)轉(zhuǎn)化應(yīng)用。iPSC是未來SC治療的發(fā)展方向，但涉及臨床應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)問題尚存在倫理、安全、免疫、體內(nèi)演變不可控等問題。我們把iPSC的創(chuàng)制和應(yīng)用研究作為遠(yuǎn)期項(xiàng)目，重點(diǎn)開展基礎(chǔ)研究，努力突破iPSC誘導(dǎo)技術(shù)，積極探討iPSC的體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)制，為療效評(píng)價(jià)及臨床研究奠定基礎(chǔ)。

2 干細(xì)胞治療研究策略

本課題組利用自身的技術(shù)優(yōu)勢，對SC治療重大疾病的臨床前研究技術(shù)進(jìn)行了試探性研究，然后選定重點(diǎn)方向并組織力量進(jìn)行集中攻關(guān)，先后申請并參與承擔(dān)了國家“973”項(xiàng)目，主持承擔(dān)國家科技支撐計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、軍隊(duì)醫(yī)學(xué)科技項(xiàng)目、省級(jí)科技計(jì)劃專項(xiàng)等20余個(gè)重要課題。我們的研究策略是瞄準(zhǔn)臨床應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)性研究和協(xié)同攻關(guān)，從基礎(chǔ)工作做起，循序漸進(jìn)，重點(diǎn)突破，建立集成技術(shù)及規(guī)范。實(shí)施路線：（1）解決SC來源和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)問題，制備儲(chǔ)存足夠數(shù)量的臨床級(jí)SC制劑，為深入研究提供標(biāo)準(zhǔn)化種子細(xì)胞；（2）進(jìn)行SC的安全性評(píng)價(jià)以保證治療安全，包括急性過敏、溶血和慢性毒性等；（3）利用疾病動(dòng)物模型進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)SC治療的療效及機(jī)制，并建立相應(yīng)技術(shù)及規(guī)范；（4）依據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)分析并制定臨床治療技術(shù)方案；（5）根據(jù)三類醫(yī)療技術(shù)管理要求，申請并開展SC治療技術(shù)的臨床研究；（6）在總結(jié)分析臨床研究結(jié)果并保證療效和安全的基礎(chǔ)上，申請臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。本課題組按照上述技術(shù)路線選取了具有臨床應(yīng)用優(yōu)勢的骨髓干細(xì)胞（bonemesenchymal stem cell，BMSC）、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC）為重點(diǎn)方向，對SC臨床治療涉及的細(xì)胞來源及標(biāo)準(zhǔn)化、臨床療效與安全、臨床技術(shù)方案等關(guān)鍵技術(shù)展開研究。結(jié)果建立了BMSC、UC-MSC的規(guī)?；苽浼夹g(shù)，研制成功SC臨床制劑，建成了SC種子資源庫；研究開展了人類疾病的動(dòng)物模型創(chuàng)建工作，利用動(dòng)物模型評(píng)價(jià)SC治療的有效性和安全性，通過動(dòng)物疾病模型治療實(shí)驗(yàn)建立臨床技術(shù)方案，同時(shí)把療效機(jī)制研究貫穿于動(dòng)物治療實(shí)驗(yàn)的全過程。

3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療技術(shù)研究

BMSC來源于自體，在臨床上具有優(yōu)先應(yīng)用的可能性。問題是自體BMSC隨年齡增長或因藥物、疾病等原因?qū)е聰?shù)量減少，增殖能力下降，體外擴(kuò)增相對困難。解決BMSC的來源問題，獲得足夠數(shù)量并符合臨床需要的BMSC，是保證臨床治療的有效性和安全性的基礎(chǔ)。我們對BMSC的生長特性進(jìn)行了深入分析，通過優(yōu)選基礎(chǔ)培養(yǎng)基、添加生長因子、改進(jìn)技術(shù)方法等，建立了一套自體BMSC體外制備、擴(kuò)增與鑒定技術(shù)體系[3]。經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化體外培養(yǎng)條件等方法，進(jìn)一步完善了BMSC體外制備方法，顯著提高了BMSC的體外擴(kuò)增效率，建成了臨床級(jí)BMSC實(shí)驗(yàn)室制備技術(shù)及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)生長特性、表型標(biāo)志、分化潛能、染色體結(jié)構(gòu)及體內(nèi)生物效應(yīng)分析，證明利用上述技術(shù)體系獲得的傳代BMSC具有原代BMSC的生物學(xué)特性[4]。該項(xiàng)目先后按照技術(shù)規(guī)范完成了1000余份人和動(dòng)物BMSC制備與鑒定研究，實(shí)現(xiàn)了制備技術(shù)規(guī)范化、細(xì)胞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化，具備了規(guī)?；苽浜蜑榕R床治療提供自體BMSC的技術(shù)條件。

4 臍帶間充干細(xì)胞技術(shù)研究及種子資源庫建設(shè)

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，HUC-MSC）來源于新生兒臍帶，具有與BMSC相似的生物學(xué)特性，體外生長能力更強(qiáng)大。該細(xì)胞的最大特點(diǎn)是取材比較方便，來源豐富，可以實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)和儲(chǔ)存。理論上，1條長50 cm的臍帶經(jīng)過體外分離并擴(kuò)增8代左右，可獲得1×1010個(gè)以上的HUC-MSC，可滿足上千人治療使用，且易于控制質(zhì)量。該細(xì)胞的應(yīng)用優(yōu)勢是免疫原性低，異體移植一般不會(huì)引起明顯的毒性和免疫排斥反應(yīng)，臨床應(yīng)用比較方便。本課題組在多項(xiàng)專項(xiàng)基金支持下，研究建立了相對完善的HUC-MSC材料采集、規(guī)?；苽洹㈣b定技術(shù)和質(zhì)量控制技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)，解決了大規(guī)模儲(chǔ)存、運(yùn)輸和復(fù)蘇關(guān)鍵技術(shù)問題，研制成功了HUC-MSC臨床標(biāo)準(zhǔn)化制劑。對HUC-MSC臨床制劑進(jìn)行了急性過敏、溶血等毒性實(shí)驗(yàn)，從血液細(xì)胞與生化、重要器官功能和組織學(xué)結(jié)構(gòu)等方面，系統(tǒng)研究了同種和異種HUC-MSC移植后的慢性毒性反應(yīng)，證實(shí)從1×106～1×107細(xì)胞/kg的劑量范圍輸入同種，甚至是異種HUC-MSC，均不引起明顯的急慢性毒性反應(yīng)。該項(xiàng)目還利用多種腫瘤小鼠模型和健康小鼠，觀察了HUC-MSC治療的促瘤和致瘤性，證明該細(xì)胞不會(huì)誘發(fā)和促進(jìn)腫瘤生長。在成功研制標(biāo)準(zhǔn)化HUC-MSC制劑的基礎(chǔ)上，啟動(dòng)了HUC-MSC庫建設(shè)，按前期建立的技術(shù)規(guī)范，制備儲(chǔ)存了6000人份（1×107細(xì)胞/份）HUC-MSC原代細(xì)胞。該研究完成了HUC-MSC中試規(guī)模制備技術(shù)，建立了HUC-MSC示范庫，可為臨床治療和進(jìn)一步研究提供標(biāo)準(zhǔn)化種子細(xì)胞。

5 干細(xì)胞治療的療效、機(jī)制及技術(shù)方案研究

SC治療非血液系統(tǒng)疾病，特別是戰(zhàn)創(chuàng)傷修復(fù)治療，首先要解決一些基本問題，其中最重要的是保障安全，弄清其療效和機(jī)制。最基本的是要通過疾病模型治療研究建立臨床技術(shù)規(guī)范，包括疾病治療適應(yīng)證、治療途徑、細(xì)胞劑量、療效評(píng)估及安全性等。本課題組在建立BMSC和HUC-MSC制備技術(shù)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，先后創(chuàng)建了全身性放射傷、骨缺損、缺血性腦損傷、肌萎縮、中毒性肝損傷、急慢性腎損傷、胰腺損傷、代謝綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肺纖維化、衰老退變、創(chuàng)傷性顱腦損傷等疾病的動(dòng)物模型，利用這些疾病動(dòng)物模型進(jìn)行了BMSC、HUC-MSC等不同來源SC治療的療效和安全性研究。通過疾病動(dòng)物模型治療實(shí)驗(yàn)，分析觀察了干細(xì)胞在體內(nèi)遷移、分布、定植、分化和參與或促進(jìn)損傷修復(fù)的部分療效機(jī)制[5-9]，建立了可供臨床參考的技術(shù)方案。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSC具有促進(jìn)多種損傷的修復(fù)、改善代謝功能、抑制自身免疫反應(yīng)等作用，其體內(nèi)生物效應(yīng)機(jī)制有：（1）歸巢到損傷組織參與損傷修復(fù)；（2）分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)損傷組織的原位細(xì)胞生長；（3）調(diào)節(jié)免疫平衡和抑制炎癥反應(yīng)，控制繼發(fā)性損傷；（4）促進(jìn)損傷組織的血管再生，改善血液循環(huán)；（5）促進(jìn)抗氧化應(yīng)激因子表達(dá)，減少損傷組織細(xì)胞凋亡等。通過分析總結(jié)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，課題組建立12項(xiàng)SC臨床治療方案，其中BMSC治療神經(jīng)損傷、肝腎損傷、自身免疫性肝病等技術(shù)已按三類醫(yī)療技術(shù)準(zhǔn)入要求申請臨床研究。

6 體細(xì)胞重編程技術(shù)及應(yīng)用基礎(chǔ)研究

體細(xì)胞重編程是近年SC技術(shù)領(lǐng)域的重大技術(shù)突破之一，其核心是利用體細(xì)胞核移植、轉(zhuǎn)基因或天然活性物質(zhì)、小分子化合物等誘導(dǎo)成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞，即iPSC。這類SC具備ESC的強(qiáng)大分化潛能，避免了ESC的倫理、免疫排斥等問題，最具發(fā)展前景。目前，美國、日本等國已開展iPSC治療老年性黃斑病變等疾病臨床研究并取得突破。本課題組在動(dòng)物克隆技術(shù)的啟示下，開展了卵細(xì)胞提取物誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物卵細(xì)胞提取物可誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSC，經(jīng)表觀遺傳學(xué)分析證實(shí)，這種方法可誘導(dǎo)SC相關(guān)基因Oct-4、Nanog、Sox2、c-myc等去甲基化，從而促使皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為SC。通過體外定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該細(xì)胞具有向神經(jīng)、骨、軟骨、肌肉等細(xì)胞分化的潛能[10]。利用放射傷、骨創(chuàng)傷、化學(xué)誘導(dǎo)性腎和胰腺損傷等動(dòng)物模型研究，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞具有促進(jìn)放射傷動(dòng)物造血免疫功能重建和參與或促進(jìn)損傷修復(fù)的作用[11]。該研究的重要貢獻(xiàn)是發(fā)明了誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的新技術(shù)，這種技術(shù)獲得的SC不涉及外源基因轉(zhuǎn)移，臨床應(yīng)用無倫理爭議，更具有臨床應(yīng)用優(yōu)勢。該技術(shù)目前在國內(nèi)外未見類似研究報(bào)道，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，值得深入研究。

7 干細(xì)胞治療技術(shù)存在的問題及展望

最近10年來，在SC技術(shù)研究不斷取得突破的同時(shí)，臨床治療研究也在發(fā)展，國際上有數(shù)千個(gè)臨床研究方案正在實(shí)施。國內(nèi)SC技術(shù)應(yīng)用主要在條件較好的大型綜合醫(yī)院開展HSC移植治療，而SC治療非血液系統(tǒng)疾病主要集中于臨床前研究。目前，國內(nèi)SC臨床治療技術(shù)尚缺乏有效的監(jiān)管措施，未建立在技術(shù)及規(guī)范方面的第三方評(píng)價(jià)技術(shù)體系和機(jī)構(gòu)，還存在商業(yè)炒作、過于夸大SC治療的作用，甚至把SC抗衰老和美容作為賣點(diǎn)大肆進(jìn)行商業(yè)宣傳等。有研究表明，SC對損傷、退變、自身免疫、血管缺血等引起的疾病有治療作用，同時(shí)對延緩衰老有一定幫助，但需要在規(guī)范管理和保證安全的前提下開展。即便是MSC或HUC-MSC，涉及臨床治療也還有諸多技術(shù)問題需要解決，例如治療的適應(yīng)證、時(shí)機(jī)、途徑、劑量、次數(shù)、療效評(píng)價(jià)、作用機(jī)制等均需要深入研究，通過大數(shù)據(jù)分析才能建立技術(shù)規(guī)范和推廣應(yīng)用。選擇一些療效確切、安全可靠、確實(shí)可行的疾病進(jìn)行臨床治療研究和先行先試是有必要的，但須在技術(shù)成熟的基礎(chǔ)上進(jìn)行。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，MSC可有效修復(fù)系統(tǒng)性損傷，可降低全身放射損傷的死亡率，促進(jìn)造血及皮膚、胃腸損傷修復(fù)，促進(jìn)自身免疫損傷，改善腎功能。SC治療技術(shù)對現(xiàn)代高新技術(shù)武器傷治療具有特殊意義，特別是在高新技術(shù)武器傷造成的批量系統(tǒng)性損傷的傷員救治中可能發(fā)揮重要作用。建議建設(shè)國防干細(xì)胞庫，為戰(zhàn)傷救治及應(yīng)急需要儲(chǔ)備一定數(shù)量的臨床級(jí)干細(xì)胞制劑；針對提高極端環(huán)境（高寒缺氧、高熱高濕）軍事作業(yè)能力及SC治療復(fù)合創(chuàng)傷、新型武器傷的技術(shù)和機(jī)制開展一些專題研究。隨著SC技術(shù)的發(fā)展及高通量基因測序、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、生物芯片等技術(shù)的應(yīng)用，SC在軍事醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的作用將不斷凸現(xiàn)。

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1004-0188（2015）08-0840-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.010

2015-03-26）

國家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB5181060）;國家自然科學(xué)基金(31172170);云南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室

潘興華,E-mail:xinghuapan@aliyun.com