范文來,徐 巖,溫永柱

(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀酒微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室,江蘇無錫 214122)

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白酒發(fā)酵與蒸餾過程中5種生物胺變化

范文來,徐 巖*,溫永柱

(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀酒微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室,江蘇無錫 214122)

應(yīng)用液液微萃取(LLME)結(jié)合高效液相色譜(HPLC)檢測(cè),建立了白酒固態(tài)發(fā)酵酒醅中多種生物胺的定量分析方法。以某兼香型酒K廠酒醅為試樣,對(duì)酒醅發(fā)酵及蒸餾過程中生物胺的變化進(jìn)行研究,定量方法包括震蕩提取、離心、液液微萃取、丹磺酰氯柱前衍生、RP-HPLC檢測(cè)。結(jié)果表明,腐胺和尸胺隨著酒醅發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),含量增加,且只有很少量的被蒸餾進(jìn)入酒中。吡咯烷是白酒的主要生物胺,在蒸餾過程中大部分被蒸餾出來。與其它飲料酒相比,白酒中的生物胺含量是最低的。

白酒,生物胺,發(fā)酵,蒸餾,衍生化

生物胺是一類具有生物活性含氮的低分子量有機(jī)化合物的總稱[1],可以看作是氨分子中1～3個(gè)氫原子被烷基或芳基取代后而生成的物質(zhì),是脂肪族、酯環(huán)族或雜環(huán)族的低分子量有機(jī)堿,廣泛存在于發(fā)酵食品和飲料酒中[2-4]。

首次研究飲料酒中生物胺是1965年,當(dāng)時(shí)應(yīng)用色譜對(duì)葡萄酒中的慢性有毒物質(zhì)進(jìn)行研究,檢測(cè)到組胺。目前為止,葡萄酒、啤酒、黃酒中生物胺的研究較多[5-7],檢測(cè)到的生物胺種類達(dá)到幾十種之多,常見的是單胺類的組胺(histamine,來源于組氨酸)、酪胺(tyramine,來源于酪氨酸)、苯乙胺(2-phenylethylamine,來源于苯丙氨酸)和色胺(tryptamine,來源于色氨酸),二胺類的腐胺(putrescine,來源于鳥氨酸)和尸胺(cadaverine,來源于賴氨酸),聚多胺類的精胺(spermidine)和亞精胺(spermine,這兩個(gè)胺來源于腐胺)等[8]。最新的研究結(jié)果表明,我國(guó)啤酒中生物胺總量4.79mg/L,葡萄酒11.24mg/L,黃酒最高可達(dá)78.30mg/L[9]。

白酒中生物胺的研究較少。早期,杜木英等人利用氨基酸自動(dòng)分析液相色譜法對(duì)青稞酒發(fā)酵過程中的生物胺的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行過研究[10],但定性的生物胺較少。2013年,范文來等人對(duì)白酒中可能含有的生物胺進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定,共鑒定出9種生物胺,包括甲胺、乙胺、異戊胺、吡咯烷、環(huán)己胺、環(huán)戊胺、環(huán)庚胺、腐胺和尸胺[11]。同年,開發(fā)了白酒中生物胺檢測(cè)方法—丹磺酰氯衍生化結(jié)合紫外-反相高效液相色譜(RP-HPLC)法,并對(duì)不同香型白酒中的生物胺進(jìn)行了定量,發(fā)現(xiàn)吡咯烷在白酒中含量最高。濃香型和清香型白酒總生物胺含量較高,而醬香型白酒較低[12]。本文在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步開發(fā)固態(tài)基質(zhì)(酒醅)中生物胺的定量方法,并對(duì)酒醅發(fā)酵和蒸餾過程中生物胺的變化進(jìn)行研究,初步探索白酒中生物胺產(chǎn)生的原因,為后續(xù)研究白酒生物胺產(chǎn)生機(jī)理、開發(fā)生物胺的降低措施提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

K酒廠酒醅,由某兼香型白酒廠提供,當(dāng)天取樣后-15℃冷凍,24h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,并-15℃冷凍待用。使用時(shí),室溫解凍。

乙胺鹽酸鹽、甲胺鹽酸鹽、吡咯烷、腐胺鹽酸鹽、尸胺鹽酸鹽 購自sigma公司的純凈標(biāo)準(zhǔn)品;丹磺酰氯(Dansyl chloride) 購自美國(guó)sigma-Aldrich公司;乙腈(色譜純) 購于上海安普儀器有限公司;三氯乙酸、丁醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、飽和碳酸氫鈉 均為分析純;實(shí)驗(yàn)室專用水:超純水(Milli-Q系統(tǒng))使用前煮沸5min。

冷凍離心機(jī) Bekman公司;高效液相色譜[DIONEX SUMMIT]戴安中國(guó)有限公司;DC-12型氮吹儀 上海安普科學(xué)儀器有限公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司;渦旋儀 上海琪特分析儀器有限公司;pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 酒醅中生物胺定量方法

1.2.1 生物胺提取 參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的方法[13],取粉碎的酒醅10g加入100mL錐形瓶,三氯乙酸(5%)震蕩提取1h,3600r/min離心10min,上清液轉(zhuǎn)入小燒杯,重復(fù)提取兩次,漏斗過濾,定容到50mL。

1.2.2 分離與衍生 參考Dugo等的方法[14]并進(jìn)行了優(yōu)化,5mL提取液,加入1.5g NaCl飽和,加入3mL正丁醇、氯仿(1∶1),用pH為13的Na2CO3和NaOH緩沖溶液調(diào)pH至11.5,渦旋儀旋轉(zhuǎn)震蕩4min,收集有機(jī)相,重復(fù)萃取兩次。加入1mL 1mol/L HCl混勻,氮?dú)獯蹈?加入2mL 0.1mol/L HCl溶解,加入2mL丹磺酰氯衍生劑(9mg/mL,溶劑為丙酮),調(diào)pH為8.6,震蕩混勻后,40℃水浴避光衍生1h。反應(yīng)結(jié)束后,加入3mL乙酸乙酯,重復(fù)萃取三次,合并萃取液,氮?dú)獯蹈?加入1mL乙腈溶解,0.45μm有機(jī)濾膜過濾,進(jìn)樣。

1.2.3 液相色譜條件 參考Dugo等的方法并進(jìn)行優(yōu)化[14],Agilent C18色譜柱(4.6×250mm,5μm),檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm,柱溫為20℃,進(jìn)樣量10μL,利用外標(biāo)法峰面積定量。梯度洗脫,流速為0.4mL/min,流動(dòng)相A為乙腈,B為超純水。洗脫程序:0～6min,A為30%;6～12min,A為30%～80%;12～25min,A為80%～85%;25～32min,A為85%～30%。

1.3 白酒中生物胺測(cè)定

參照溫永柱等人的方法測(cè)定[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 固態(tài)基質(zhì)酒醅中生物胺定量方法

固態(tài)基質(zhì)酒醅中生物胺的提取采用國(guó)標(biāo)的方法[13],其測(cè)定方法依參考文獻(xiàn)的方法[12]優(yōu)化。在酒醅中添加相似濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定固態(tài)基質(zhì)中生物胺定量方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),并計(jì)算回收率。由表1可知,定量方法的精確度和準(zhǔn)確度較好,回收率在77%～105%之間,其中甲胺的回收率偏低,推測(cè)是甲胺易揮發(fā),在提取、萃取過程中損失比較大。

表1 固態(tài)基質(zhì)中定量方法的回收率和RSD(n=3)Table1 RSD and recovery ofbiological amines detected in solid matrix(n=3)

2.2 酒醅發(fā)酵過程中5種生物胺變化

根據(jù)建立的固態(tài)白酒酒醅中生物胺的定量方法對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間的酒醅進(jìn)行定量檢測(cè)。選取5個(gè)時(shí)間點(diǎn),即發(fā)酵0、10、20、30和60d酒醅,圖1是5種生物胺在酒醅發(fā)酵過程中的變化趨勢(shì)。

圖1 K酒廠酒醅中5種生物胺含量各自隨著時(shí)間的變化Fig.1 Changes of biogenic amines of fermented grain from K distillery in the fermentation

酒醅發(fā)酵過程中生物胺總量先隨發(fā)酵時(shí)間上升,到達(dá)20d時(shí)生物胺總含量最高,達(dá)16mg/kg;20d后,腐胺含量先下降,再升高,尸胺含量繼續(xù)增加,但由于甲胺、乙胺、吡咯烷含量開始下降,致使生物胺總量也開始下降;到達(dá)60d時(shí)總含量達(dá)11.78mg/kg。

從單個(gè)生物胺變化看,酒醅發(fā)酵過程中,甲胺、乙胺、吡咯烷一般先上升后下降(圖1),在20d時(shí)含量達(dá)到最高,吡咯烷含量居首,最高含量達(dá)到5mg/kg。腐胺是前10d含量變化不大,10～20d含量迅速增加,在20d時(shí)達(dá)到最大值,高出最初含量的一倍;20～30d會(huì)下降,但是依然高出初始值;30～60d,腐胺含量平緩上升。推測(cè)酒醅中微生物陸續(xù)死亡,腐胺積累。腐胺的這一變化與早先文獻(xiàn)報(bào)道腐胺隨著發(fā)酵進(jìn)行呈下降趨勢(shì)不一樣[10]。尸胺初始值為0,從第10～60d,含量一直處于上升狀態(tài)。在發(fā)酵至60d時(shí),尸胺含量是5種生物胺中最高的,達(dá)到3.44mg/kg。

表2 不同餾分酒中生物胺的含量(μg/L)Table2 The concentration of biogenic amines of head,heart,and tail cut(μg/L)

注:*:q.l.,小于檢測(cè)限。

2.3 酒醅配料、蒸餾前后生物胺的變化

兼香型K廠酒醅在配料前至蒸餾后的整個(gè)過程中,5種生物胺的變化趨勢(shì)基本一致(圖2)。配料時(shí),由于加入新料,原來酒醅中的生物胺得到稀釋,從而使生物胺含量都得到了大幅度的降低。配料前,酒醅生物胺總量是10.46mg/kg,配料后下降到6.93mg/kg,下降了33.74%。其中尸胺的含量降低最大,但乙胺含量幾乎未變。

蒸餾后,酒醅中總生物胺含量下降至5.01mg/kg,蒸餾過程下降了27.71%。單個(gè)生物胺下降趨勢(shì)差異較大,其中吡咯烷和乙胺含量降低最大,而尸胺、腐胺含量降低幅度較小,甲胺下降趨勢(shì)居中。推測(cè)由于腐胺和尸胺沸點(diǎn)較高(分別為158℃和178℃),高于白酒蒸餾時(shí)的溫度,大部分殘留在酒醅中。

圖2 K酒酒醅蒸餾前后5種生物胺含量的變化Fig.2 The concentration of biogenic amines before and after distillation of fermented grains from K distillery

2.4 白酒蒸餾過程中5種生物胺含量變化規(guī)律

酒頭、中段酒、尾酒中,甲胺和乙胺含量都是在中段酒時(shí)含量最大(表2),結(jié)合蒸餾過程酒醅中甲胺和乙胺含量的變化,說明酒醅中大部分的甲胺和乙胺都隨著蒸餾過程到達(dá)餾分中,并且主要在前中期蒸餾出來。蒸餾過程中,吡咯烷從酒醅進(jìn)入餾分的量最大,中段酒中吡咯烷的含量達(dá)到750μg/L。在整個(gè)蒸餾過程中,尤其是中段酒和尾酒中,吡咯烷的含量一直保持一個(gè)很高的含量。對(duì)腐胺而言,在尾酒中含量達(dá)到最高,可能是因?yàn)楦贩悬c(diǎn)較高(158℃)。尸胺在各餾分中均低于檢測(cè)限。從白酒中段酒與酒頭的生物胺含量可知,白酒中生物胺的含量要低于瑞士、德國(guó)、法國(guó)葡萄酒限量標(biāo)準(zhǔn)(分別為10、2、8mg/L)[15-16]。

3 結(jié)論

建立了白酒固態(tài)基質(zhì)中多種生物胺的HPLC定量方法,并對(duì)酒醅發(fā)酵過程中5種生物胺甲胺、乙胺、吡咯烷、腐胺、尸胺的變化進(jìn)行了研究。酒醅發(fā)酵過程中生物胺總量前20d隨發(fā)酵時(shí)間上升,然后逐漸下降,至發(fā)酵60d(出窖時(shí))達(dá)11.78mg/kg。除尸胺是隨著發(fā)酵時(shí)間一直上升外,其它4個(gè)生物胺在發(fā)酵前20d上升,然后緩慢下降。

酒醅配料降低生物胺效果好于酒醅蒸餾,二者共同作用,生物胺總量下降61.45%。

蒸餾過程中,低沸點(diǎn)的生物胺進(jìn)入酒中,且以酒頭中為主;高沸點(diǎn)的生物胺如腐胺和尸胺大部分存在于中段酒和尾酒中。這一研究結(jié)果將對(duì)在酒醅發(fā)酵和蒸餾過程中進(jìn)行生物胺的控制起到指導(dǎo)作用。

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Quantification for 5 selected biogenic amines in fermentation and distillation of Chinese liquor by HPLC

FAN Wen-lai,XU Yan*,WEN Yong-zhu

(Lab of Brewing Microbiology and Applied Enzymology,Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A liquid-liquid microextraction(LLME)and reverse-phase high performance liquid chromatogramphy(HPLC)method was developed for the quantification for 5 selected biogenic amines in fermented grain and Chinese raw liquor. Quantification method generally includes:oscillation extraction,centrifugation,liquid-liquid microextraction,precolumn derivatization with Dansyl chloride,and RP-HPLC detection. The results showed that the content of putrescine and cadaverine was increased with fermentation time prolong of fermented grains,but few of them could be distilled into raw liquor. Pyrrolidine was the major biogenic amines in Chinese liquors and most could be distilled into raw liquor. Methylamine and ethylamine were detemined in fermented grains,but low concentration of them could exist in raw liquor because of their high volatility. Compared with other alcoholic beverages,Chinese liquor has the lowest content of biogenic amines.

Chinese liquor;biogenic amines;fermentation process;distillation process;derivativation

2014-06-27

范文來(1966-),男,碩士,研究員,研究方向：釀酒工程與食品安全。

*通訊作者:徐巖(1962-)，男，博士，教授，研究方向：微生物釀酒科學(xué)與酶技術(shù)。

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102108)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAK17B11)。

TS201.6

A

:1002-0306(2015)09-0144-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.023