俞永珍,鄒秀蘭,鄒玉平
綜述
線(xiàn)粒體DNA損傷與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞關(guān)系的研究進(jìn)展
俞永珍,鄒秀蘭,鄒玉平△
線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)是線(xiàn)粒體內(nèi)具有遺傳效應(yīng)的雙股閉環(huán)DNA分子,對(duì)細(xì)胞及其功能具有重要作用。視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞活動(dòng)亦由大量線(xiàn)粒體參與。因RPE細(xì)胞代謝活躍,當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)可引起線(xiàn)粒體及mtDNA損傷;當(dāng)線(xiàn)粒體及mtDNA損傷無(wú)法及時(shí)修復(fù)而使損傷積累,可引起RPE及線(xiàn)粒體功能障礙,并誘發(fā)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而引發(fā)某些眼病,如年齡相關(guān)性黃斑變性等?,F(xiàn)就mtDNA與RPE細(xì)胞的功能關(guān)系、mtDNA損傷修復(fù)及檢測(cè)方法作一綜述。
DNA,線(xiàn)粒體;DNA損傷;視網(wǎng)膜色素類(lèi);上皮細(xì)胞;活性氧;綜述
視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)是視網(wǎng)膜代謝最活躍的區(qū)域,由單層排列整齊的六面柱狀的色素細(xì)胞即RPE細(xì)胞構(gòu)成,具有吞噬降解感光細(xì)胞外節(jié)段、轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物、清除自由基等功能,這對(duì)視網(wǎng)膜自平衡及視覺(jué)有極為重要的意義[1]。研究發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體DNA(mito?chondrial DNA,mtDNA)的損傷與視網(wǎng)膜疾病密切相關(guān),位于視網(wǎng)膜最外層的RPE細(xì)胞因長(zhǎng)期暴露于光線(xiàn)刺激、高氧的環(huán)境中,易受到氧化損傷,產(chǎn)生慢性氧化應(yīng)激,這種病理變化可導(dǎo)致光視性視網(wǎng)膜損傷等眼?。?-3]。以下就mtDNA損傷和修復(fù)及與RPE細(xì)胞的關(guān)系進(jìn)行綜述。
1.1 結(jié)構(gòu)與功能線(xiàn)粒體是存在于大多數(shù)真核生物體內(nèi)的一種重要而獨(dú)特的細(xì)胞器,外膜完整包圍細(xì)胞器,內(nèi)膜因向胞質(zhì)內(nèi)褶皺形成細(xì)胞嵴;細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有酶類(lèi)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體及DNA。人類(lèi)完整的mtDNA為一個(gè)包含有16 569個(gè)堿基對(duì)的環(huán)狀雙鏈DNA分子,能夠獨(dú)立地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白的表達(dá)。mtDNA編碼37個(gè)基因及13個(gè)蛋白質(zhì)基因,其中編碼的13個(gè)亞基是線(xiàn)粒體復(fù)合物參與呼吸電子傳遞鏈所必需的,故mtDNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)對(duì)于機(jī)體的能量需求非常重要。
1.2 mtDNA基因組特性mtDNA進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)時(shí),具有遺傳多態(tài)性,并具有以下特點(diǎn):首先,雙鏈DNA完全轉(zhuǎn)錄,無(wú)內(nèi)含子,沒(méi)有高效的修復(fù)系統(tǒng);其次,mtDNA編碼的基因沒(méi)有相關(guān)組蛋白及其他蛋白的保護(hù);此外,mtDNA損傷效應(yīng)極易積累;最后,線(xiàn)粒體具有遺傳異質(zhì)性,即每個(gè)細(xì)胞有數(shù)百個(gè)線(xiàn)粒體,每個(gè)線(xiàn)粒體有多個(gè)DNA,因此一個(gè)細(xì)胞可同時(shí)具有正常和異常的mtDNA,從而可具有不同的遺傳特性[4]。由此可見(jiàn),當(dāng)mtDNA在高活性氧(reactive oxygen species,ROS)等氧化應(yīng)激狀態(tài)下,容易使基因序列發(fā)生變化,進(jìn)而使表達(dá)的蛋白發(fā)生改變,從而發(fā)生線(xiàn)粒體功能障礙及mtDNA損傷。根據(jù)mtDNA基因組的特性,與核DNA相比,mtDNA更易遭受氧化損傷,而且氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)mtDNA的損傷比核DNA大10倍且更持久[5]。
2.1 線(xiàn)粒體與自由基自由基是細(xì)胞內(nèi)的正常產(chǎn)物,機(jī)體內(nèi)自身存在產(chǎn)生-清除-抗氧化防御系統(tǒng),細(xì)胞可通過(guò)酶類(lèi)及抗氧化劑類(lèi),將產(chǎn)生的自由基清除或抵消。其中線(xiàn)粒體是體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生的主要場(chǎng)所,也是氧化損傷的靶細(xì)胞器。線(xiàn)粒體損傷與活性氧ROS的水平有關(guān),其中mtDNA對(duì)氧化損傷更加敏感[6]。當(dāng)ROS不能及時(shí)清除而積累于細(xì)胞中時(shí),線(xiàn)粒體將受到氧自由基的攻擊,一方面可引起線(xiàn)粒體數(shù)量減少、腫脹變形,線(xiàn)粒體能量動(dòng)力學(xué)改變;另一方面引起線(xiàn)粒體氧化呼吸鏈的功能障礙,導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加,可進(jìn)一步誘導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7-8]。
2.2 RPE細(xì)胞與氧化損傷RPE細(xì)胞具有支持感光細(xì)胞、維持視網(wǎng)膜外屏障穩(wěn)定、運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等作用,故RPE所在區(qū)域代謝活躍,耗氧量高;且在RPE細(xì)胞內(nèi)含有豐富的線(xiàn)粒體及溶酶體等亞細(xì)胞器。線(xiàn)粒體為RPE細(xì)胞提供代謝所需要的氧和腺嘌呤三磷酸腺苷(adenine adenosine triphosphate,ATP),因此在氧化呼吸過(guò)程中也生成了大量自由基。此外,RPE細(xì)胞屬于終末有絲分裂細(xì)胞,一旦視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞受損或死亡,則不能再生,只能依靠鄰近的RPE細(xì)胞的擴(kuò)張和移行來(lái)填補(bǔ)缺損區(qū)[9]。然而,RPE細(xì)胞內(nèi)包含黑色素和脂褐素2種特殊類(lèi)型的色素,通過(guò)吸收光線(xiàn)形成了一個(gè)輻射過(guò)濾裝置,從而保護(hù)了眼內(nèi)細(xì)胞免遭高能量的氧化損傷。
黑色素主要是胚胎時(shí)期及出生后第1年逐漸合成的,可產(chǎn)生超氧陰離子(O-2)及H2O2。Boulton[10]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)光可誘導(dǎo)黑色素小體發(fā)生光動(dòng)力反應(yīng)而產(chǎn)生ROS。脂褐素是RPE細(xì)胞吞噬、消化感光細(xì)胞外節(jié)后的殘留物,當(dāng)感光細(xì)胞外節(jié)受到光照刺激發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),脂褐素可產(chǎn)生不同的熒光基團(tuán)[11],其中N視黃基N視黃乙醇胺(N-retinylidene-N-retiny?thanolenrine,A2E)是最主要的熒光基團(tuán)。研究表明脂褐素在光化效應(yīng)中產(chǎn)生大量ROS,進(jìn)而對(duì)體外培養(yǎng)的色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生光毒性[12]。隨著年齡的增加,RPE細(xì)胞中的脂褐素不斷累積,脂褐素的光化學(xué)反應(yīng)亦增強(qiáng),主要通過(guò)A2E特異性破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其他小分子結(jié)構(gòu),最終可導(dǎo)致RPE細(xì)胞及線(xiàn)粒體功能障礙,進(jìn)而影響視網(wǎng)膜正常生理功能的發(fā)揮,這與年齡相關(guān)性視網(wǎng)膜疾病,如年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)生密切相關(guān)[13]。
2.3 線(xiàn)粒體與RPE細(xì)胞凋亡Li等[14]認(rèn)為凋亡是RPE細(xì)胞氧化損傷的主要機(jī)制。其中RPE細(xì)胞線(xiàn)粒體在調(diào)控凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起重要作用[15]。研究證實(shí),大量ROS未能及時(shí)清除時(shí),機(jī)體發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)可誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜電位降低,線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrialpermeability transi?tion pore,MPTP)開(kāi)放,線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C釋放入胞漿[16];同時(shí)線(xiàn)粒體MPTP能將Bax蛋白聚集在線(xiàn)粒體膜孔道周邊,使形成更大的MPTP,導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的高滲性,從而激活凋亡誘導(dǎo)因子、pro-caspase-3等細(xì)胞凋亡因子,由此觸發(fā)并激活細(xì)胞的凋亡系統(tǒng),引起細(xì)胞凋亡[17]。
3.1 衰老與mtDNA損傷衰老在機(jī)體表現(xiàn)為自身功能減退、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力及應(yīng)激能力下降,其發(fā)展過(guò)程與線(xiàn)粒體功能異常關(guān)系密切,在線(xiàn)粒體主要以mtDNA形態(tài)變化、片段缺失、基因突變、mtDNA甲基化等生物學(xué)變化為主。早期Miquel和Cowoker提出線(xiàn)粒體損傷是細(xì)胞衰老和死亡的基礎(chǔ)。此外,線(xiàn)粒體產(chǎn)生的自由基對(duì)衰老也有促進(jìn)作用。由線(xiàn)粒體釋放的信號(hào)分子,如鈣離子、ROS、ATP及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucletide,NADH)可通過(guò)調(diào)控代謝的狀態(tài)激活特定的細(xì)胞通路,進(jìn)而引起信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng),引發(fā)線(xiàn)粒體調(diào)控衰老的生物活動(dòng)[18-19]。
3.2 視網(wǎng)膜mtDNA的損傷及修復(fù)盡管線(xiàn)粒體的功能障礙與視網(wǎng)膜有關(guān),但關(guān)于視網(wǎng)膜內(nèi)mtDNA的損傷及修復(fù)機(jī)制的闡述并不十分清楚。視網(wǎng)膜mtDNA的損傷多見(jiàn)于衰老及氧化損傷,損傷發(fā)生后常伴有8-羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤(8-oxodG)位點(diǎn)損傷,此時(shí)主要通過(guò)腺嘌呤DNA糖苷酶、變位酶γ等DNA修復(fù)酶及堿基切除的方式,抑制8-oxodG表達(dá)活性或被特異性切除,從而修復(fù)損傷的mtDNA。研究已證實(shí)年齡、ROS、mtDNA損傷的積累及氧化刺激等因素可導(dǎo)致mtDNA氧化損傷修復(fù)功能降低或抑制[20],這可能主要與mtDNA修復(fù)酶活性降低及mtDNA損傷修復(fù)基因如8-羥基鳥(niǎo)嘌呤DNA糖苷酶1(8-oxoguanine-DNA glycosylate,OGG1)有關(guān)[21]。Rózanowski等[22]也認(rèn)為,隨著年齡的增加,mtDNA的損傷不斷增加,而mtDNA修復(fù)酶的活性逐漸降低,mtDNA修復(fù)酶8-氧鳥(niǎo)嘌呤-糖基化酶基因及蛋白表達(dá)水平均下降。
3.3 mtDNA氧化損傷的檢測(cè)方法mtDNA氧化損傷的檢測(cè)方法主要包括免疫化學(xué)方法、高表型液相色譜、氣相色譜分析、電化學(xué)質(zhì)譜學(xué)及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),如單鏈構(gòu)象多態(tài)性、連接介導(dǎo)PCR(ligation-mediated PCR,LM-PCR)[23]。實(shí)驗(yàn)中mtDNA提取純化過(guò)程會(huì)對(duì)mtDNA造成人為的損傷,因此有研究人員提出了基因和基因組特異性PCR擴(kuò)增,通過(guò)這種方法可以檢測(cè)到mtDNA的損傷及修復(fù)[24]。目前,該方法被應(yīng)用到體內(nèi)和體外的各種模型,以探測(cè)由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致的mtDNA損傷的特異性。其原理是:當(dāng)DNA的雙鏈發(fā)生氧化損傷時(shí),DNA聚合酶不能在PCR反應(yīng)中起作用,從而降低基因組片段的復(fù)制。因此,只有那些DNA聚合酶正常工作的DNA模板才可以正常進(jìn)行擴(kuò)增。
由此可知,線(xiàn)粒體、mtDNA的結(jié)構(gòu)和功能及RPE細(xì)胞的生理特性,決定了線(xiàn)粒體可產(chǎn)生大量以ROS為代表的自由基,并發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。這可能是導(dǎo)致線(xiàn)粒體、mtDNA及RPE細(xì)胞氧化損傷的主要原因之一。此外,衰老也與mtD?NA及RPE細(xì)胞的功能障礙密切相關(guān)。一旦損傷積累或損傷修復(fù)功能抑制或降低時(shí),將嚴(yán)重影響線(xiàn)粒體、mtDNA及RPE細(xì)胞功能,從而誘發(fā)視網(wǎng)膜相關(guān)眼病的發(fā)生。
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(2014-08-10收稿2015-04-08修回)
(本文編輯李鵬)
The relationship between mitochondrial DNA damage and retinal pigment epithelium cells
YU Yongzhen,ZOU Xiulan,ZOU Yuping△
Department of Ophthalmology,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou 510010,China;△
Mitochondrial DNA(mtDNA)is a genetic effect DNA molecule of double closed loop,and is crucial for cells and their functions.Mitochondria take an active part in physiological activities of retinal pigment epithelium(RPE)cells. The oxidative stress is usually occurred in RPE for its active metabolism,which can lead to mitochondria and mtDNA dam?age.Once mitochondria and mtDNA lesions have not been repaired timely,the lesions can be accumulated,which can cause dysfunctions and damaged-structures of RPE and mitochondria,and can motivate the progression of cell apoptosis.In the end it can result in some ocular related diseases such as aged-related macular degeneration(AMD).This study reviewed the functional relationship between mtDNA and RPE,and repair and detection methods of mtDNA damage.
DNA,mitochondrial;DNA damage;retinal pigments;epithelial cells;reactive oxygen species;review
R774
A
10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.034
廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B031800202,2012B031800409)
1廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院眼科(郵編510010);2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院眼科
俞永珍(1989),女,研究生,碩士,主用從事眼底病研究
△通訊作者E-mail:gzzouyuping@sina.com