黃海霞，侯東燕，辛 方，任 杰，劉 萍，王 偉

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069)

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·論 著·

肌動蛋白對結(jié)腸平滑肌大電導(dǎo)鈣激活鉀通道機械敏感性的影響

黃海霞，侯東燕，辛 方，任 杰，劉 萍，王 偉*

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069)

目的探討大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large conductance calcium-activated potassium channels，BK)機械敏感性與肌動蛋白的關(guān)系。方法采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)檢測BK各亞基信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)水平；應(yīng)用膜片鉗技術(shù)記錄小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞 BK的單通道活動，確定其機械敏感性；應(yīng)用細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B,Cyto B)破壞肌動蛋白，探討肌動蛋白對BK機械敏感性的影響。結(jié)果小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞BK由α和β1亞基構(gòu)成；BK的開放概率隨施加在膜片上的負(fù)壓刺激的增加而強度依賴性增加；破壞細(xì)胞骨架不影響通道的機械敏感性。結(jié)論小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞BK對機械刺激敏感，且具有強度依賴性；BK機械敏感性不依賴于肌動蛋白的完整性，內(nèi)襯于細(xì)胞膜下的皮質(zhì)肌動蛋白可能分擔(dān)膜張力，從而保護(hù)BK免受過度的牽張刺激。

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道；肌動蛋白類；肌細(xì)胞，平滑肌

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large conductance calcium-activated potassium channels，BK)是消化道平滑肌細(xì)胞上主要的鉀通道成員，具有機械敏感性[1-2]，可能參與了平滑肌細(xì)胞對機械力的感受。關(guān)于機械外力是如何激活離子通道的，目前仍無定論。Naruse等[3]的研究認(rèn)為雞胚心肌BK的機械敏感性取決于位于α亞基C端的應(yīng)激軸調(diào)節(jié)外顯子(stress-axis regulated exon，STREX)片段，其中的A674氨基酸殘基是力學(xué)信息偶聯(lián)的必要結(jié)構(gòu)。而S6跨膜片段和鉀電導(dǎo)調(diào)控元件(regulatory domains of potassium conductance，RCK)之間的連接片段(linker)的長短則決定著傳遞到通道的外力的大小[4]。然而，近年研究發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸平滑肌BK 的α亞基不包含STREX外顯子(稱為ZERO型剪切體)[2,5]，但是通道仍具有機械敏感性[2]。關(guān)于外力如何引起離子通道開放概率的增加，學(xué)者們還曾提出2個模型：膜模型(bilayer model)和鏈索模型(tethered model)[6]。前者設(shè)想應(yīng)力通過膜脂質(zhì)分子直接作用到通道，引起通道開放；而后者假設(shè)外力通過膜內(nèi)偶聯(lián)成分(如細(xì)胞骨架)作用于通道分子。研究發(fā)現(xiàn)破壞細(xì)胞骨架可以增加骨細(xì)胞的機械敏感性[7]，而細(xì)胞骨架在機械刺激激活經(jīng)典型瞬時感受器電位通道(classical transient receptor potential channels，TRPC)家族成員TRPC5通道中是必須的，破壞細(xì)胞骨架后該通道不能被機械刺激激活[8]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架不是心肌ATP敏感鉀通道(ATP sensitive potassium channels，KATP)感受機械刺激的必要成分，只是作為并聯(lián)成分調(diào)節(jié)加載在通道上的膜張力[9]。本實驗旨在研究細(xì)胞骨架的主要成分——肌動蛋白對小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞BK通道感受機械刺激的影響，以期揭示BK的機械敏感性機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的急性分離 健康成年Balb/c小鼠，體質(zhì)量(25±5) g，雌雄不拘，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供[許可證號為:SCXK-(軍)2007-004]。禁食12 h，斷頸處死，取結(jié)腸組織，置于冰無鈣Hanks液：NaCl 125 mmol/L，KCl 5.36 mmol/L，NaHCO315.5 mmol/L，Na2HPO40.336 mmol/L，KH2PO40.44 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，蔗糖 2.9 mmol/L，羥乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，HEPES) 11 mmol/L， pH為7.2。去除黏膜層，保留平滑肌層，剪碎，置于酶液中37 ℃水浴消化12 min。酶液成分為：4 g/L牛血清白蛋白，14 U/mL木瓜蛋白酶，230 kU/L Ⅱ型膠原酶和 1 mmol/L 胰蛋白酶抑制劑。Ⅱ型膠原酶購自美國 Worthington 公司，其他試劑均購自Sigma-Aldrich公司。去除酶液，加入無鈣 Hanks液，輕輕吹打，將細(xì)胞懸液滴加在圓玻片上，靜置10 min，待貼壁后加入無鈣 Hanks液儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測 用 Trizol-氯仿-異丙醇法從新鮮分離的結(jié)腸平滑肌組織或急性分離的結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第1鏈，反應(yīng)條件：55 ℃，50 min，85 ℃，5 min，然后進(jìn)行 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction， PCR)擴增。Trizol和RT-PCR兩步法試劑盒為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。PCR引物用 Oligo 6.0和Primier 5.0軟件聯(lián)合設(shè)計，由上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58～60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；反應(yīng)結(jié)束后72 ℃延伸 10 min。內(nèi)參為磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙銨染色，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)和Quantity-One軟件采集分析。BK各亞基和GAPDH的引物，見表1。

表1 BKα和β亞基及GAPDH mRNA擴增引物序列及預(yù)期產(chǎn)物片段大小

1.3 膜片鉗實驗 實驗選擇表面干凈、折光性強、無收縮、貼壁良好的結(jié)腸平滑肌細(xì)胞用于封接。電極選用美國 Sutter公司生產(chǎn)的內(nèi)徑1.1 mm、外徑1.5 mm的毛細(xì)玻璃管在電極拉制儀上(PB27，Narishige，日本)用兩步法拉制出電極阻抗6～10 MΩ的玻璃微電極。實驗聯(lián)合應(yīng)用膜片鉗和壓力控制技術(shù)記錄通道的活動和對膜片施加負(fù)壓刺激。單通道電流信號經(jīng)膜片鉗放大器Axopatch 200A(Axon Instruments，美國)輸入數(shù)模轉(zhuǎn)換器Digidata 1322(Axon Instruments，美國)，采用pClamp 9.0專用軟件進(jìn)行記錄。放大器的增益為100 mV/pA,采用2 kHz 的低通濾波,采樣頻率20 kHz。應(yīng)用 pClamp 9.0單通道活動分析軟件分析單通道數(shù)據(jù)。利用壓力控制裝置(Dale20，Luke Biomedical，英國)向電極內(nèi)施加負(fù)壓來對膜片施加牽拉刺激。由于BK分布密度較高，一個膜片上往往有多個BK通道，但是數(shù)目未知，故此采用總開放概率(open probability，NPo)來代表通道活動，N為膜片中最大通道數(shù)目，Po為單通道的開放概率。每一數(shù)據(jù)選取5 s的穩(wěn)定值進(jìn)行分析。實驗采用膜內(nèi)向外模式，電極內(nèi)外液均為天冬氨酸鉀140 mmol/L，EGTA 5 mmol/L，MgCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，pH調(diào)節(jié)到7.4。細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B，Sigma-Aldrich，美國)用二甲基亞砜溶解，用浴池液稀釋至終濃度20 μmol/L，二甲基亞砜的終濃度不超過0.1%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù)，計量資料比較分別采用F檢驗、q檢驗和配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BKα和β1亞基在小鼠結(jié)腸平滑肌中的表達(dá) PCR產(chǎn)物顯示小鼠結(jié)腸平滑肌組織上可以檢測到BK α 和 β1、β2、β4亞基的表達(dá)(圖1A)。實驗選取了睪丸組織做陽性對照(圖1B)。由于小鼠結(jié)腸平滑肌組織中可能混有其他組織，實驗進(jìn)一步在光鏡下收集急性分離的平滑肌細(xì)胞60個左右，檢測BK α 和β亞基的表達(dá)情況。PCR產(chǎn)物顯示小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上僅檢測到BK α和β1亞基的表達(dá)(圖1C)。

2.2 小鼠結(jié)腸平滑肌BK可被機械刺激強度依賴性激活 采用膜內(nèi)向外模式，膜電位鉗制于+40 mV，利用壓力控制裝置對膜片施加負(fù)壓刺激，記錄BK單通道電流的活動。施加負(fù)壓刺激前(0 mmHg)，細(xì)胞膜上BK自發(fā)地隨機開放，BK的活動顯示通道只有1級開放；膜片受到牽張刺激時，BK活動立刻增加，隨著負(fù)壓刺激增加，2級開放(有2個通道同時開放)逐漸增多(圖2)。BK的NPo隨著負(fù)壓的增加而增加：負(fù)壓由0 mmHg增加至-10、-20、-30、-40 mmHg， BK的NPo隨之增加，在-30 mmHg和-40 mmHg的負(fù)壓刺激下增加更明顯(P<0.05)。見表2。

應(yīng)用指數(shù)方程(NPo=Ae-kx)來擬合通道的NPo與負(fù)壓間的關(guān)系。其中x為負(fù)壓，介于0～-40 mmHg；A為零壓力下的NPo，即通道的背景活動；k值代表通道的機械敏感性(單位是1/mmHg)。在細(xì)胞外零鈣和膜內(nèi)向外記錄模式下，BK通道的NPo與負(fù)壓刺激有很好的相關(guān)性(NPo=0.042 2e0.038 0x，R2=0.987 8，n=6)，證實BK通道的活動呈刺激強度依賴性。

表2 不同壓力下BK的NPo比較

負(fù)壓例數(shù)BK的NPo 0mmHg60.042±0.037-10mmHg60.071±0.057-20mmHg60.091±0.063-30mmHg60.119±0.084*-40mmHg60.199±0.150*F 2.822P 0.046

*P<0.05與0 mmHg比較(q檢驗)

2.3 降解細(xì)胞骨架對小鼠結(jié)腸平滑肌BK機械敏感性的影響 肌動蛋白狀態(tài)的變化可直接或間接地影響多種離子通道的活動。本實驗采用細(xì)胞松弛素B破壞F-肌動蛋白，進(jìn)一步研究細(xì)胞骨架對小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞BK通道活動的影響。圖3A來自同一個結(jié)腸平滑肌細(xì)胞膜片，采用膜內(nèi)向外模式記錄，鉗制膜電位于+40 mV。結(jié)果顯示應(yīng)用細(xì)胞松弛素B前，通道的背景活動較低，依次對膜片施加-10 mmHg到-40 mmHg的負(fù)壓刺激，可以觀察到通道NPo增加并呈刺激強度依賴性；應(yīng)用細(xì)胞松弛素B 5 min后，0 mmHg下通道的背景活動已有增加，給予-10 mmHg到-40 mmHg的階躍負(fù)壓刺激后，依然呈現(xiàn)刺激強度依賴性的通道活動增加(F=4.694,P=0.006)。在相同負(fù)壓條件下，應(yīng)用細(xì)胞松弛素B后BK的NPo均高于應(yīng)用細(xì)胞松弛素B前(P<0.05)，見表3。

數(shù)據(jù)以指數(shù)方程NPo=Ae-kx進(jìn)行擬合(圖3B)，其中x代表施加的負(fù)壓刺激。擬合結(jié)果：應(yīng)用細(xì)胞松弛素B前NPo= 0.042 2e0.038 0x(R2=0.987 8，n=6)；當(dāng)應(yīng)用細(xì)胞松弛素B 5 min后，NPo=0.097 6 e0.039 2x(R2=0.996 5，n=6)；其k值分別為0.038 0和0.039 2，十分接近。圖3C表示用半對數(shù)曲線描述通道NPo與刺激強度的關(guān)系，此時2條開放概率-壓力曲線半對數(shù)曲線基本平行，但是截距A不同。這說明細(xì)胞松弛素B只影響B(tài)K的背景活動，不影響B(tài)K的機械敏感性(即k值)。

表3 相同壓力下應(yīng)用與未應(yīng)用細(xì)胞松弛素B的NPo比較

細(xì)胞松弛素B壓力0mmHg-10mmHg-20mmHg-30mmHg-40mmHg應(yīng)用前0.042±0.0370.071±0.0570.091±0.0630.119±0.0840.199±0.150應(yīng)用后0.122±0.0870.155±0.0990.196±0.1050.296±0.1610.484±0.286t 3.5784.4244.0673.9954.217P 0.0160.0070.0100.0100.008

3 討 論

本實驗應(yīng)用單通道膜片鉗技術(shù)，在急性分離的成年小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上采用膜內(nèi)向外的記錄模式研究BK通道的機械敏感性。研究發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞BK可以被負(fù)壓刺激強度依賴性激活，實驗中采用細(xì)胞松弛素B干預(yù)肌動蛋白的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)破壞肌動蛋白后使BK背景開放活動有所增加，而機械敏感性沒有變化。

牽張對于消化道是一種基本的生理性刺激，除了神經(jīng)和體液機制外，消化道平滑肌細(xì)胞本身也能對機械刺激作出反應(yīng)，牽張刺激可即刻引起肌細(xì)胞膜電位的變化，這可能與平滑肌細(xì)胞上機械敏感離子通道的活動相關(guān)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)BK通道是消化道平滑肌細(xì)胞上一類重要的機械敏感鉀離子通道[2,5]。然而關(guān)于消化道平滑肌細(xì)胞上BK的機械敏感性調(diào)節(jié)機制，國內(nèi)外研究較少。

生理狀態(tài)的BK由2種亞基組成，即構(gòu)成孔道部分的α亞基和發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的β亞基。完整的BK分子包含4個α亞基和4個β亞基，每個α亞基結(jié)合1個β亞基之后再形成BK的八聚體結(jié)構(gòu)。α 亞基由KCNMA編碼形成，β1～β4調(diào)節(jié)亞基分別由4個基因 KCNMB1～4編碼。這4個編碼β亞基的基因的表達(dá)具有組織特異性，其中KCNMB1主要在平滑肌中表達(dá)。本實驗也發(fā)現(xiàn)在小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上主要表達(dá)β1亞基。BK作為平滑肌鉀通道的主要類型，其去極化和胞內(nèi)鈣激活以及極高的鉀電導(dǎo)值特征，均使其在平滑肌運動控制中占據(jù)重要地位。本研究發(fā)現(xiàn)BK在無鈣條件下可以被牽張刺激強度依賴性激活，提示機械刺激可能作為一種獨立激活因素調(diào)控著BK的活動，這種機械敏感特性賦予了BK通道更多的病理生理意義。

然而有關(guān)BK的機械門控機制符合膜模型還是鏈索模型，目前尚未獲得共識。Zhao等[4]的研究強調(diào)位于BK的α亞基C末端的一些特殊的元件對機械敏感性有特殊意義。這些相關(guān)的元件包括位于連接跨膜片段S6和第1個鉀電導(dǎo)調(diào)節(jié)域的連接片段(linker)，以及位于第1個鉀電導(dǎo)調(diào)節(jié)域和第2個鉀電導(dǎo)調(diào)節(jié)域之間的STREX插入體(一種剪切體)；增加連接片段的長度會削弱通道對牽張刺激的反應(yīng)，而縮短連接片段則使得通道對牽張刺激更敏感。因此，認(rèn)為連接片段是將應(yīng)力從下游結(jié)構(gòu)域傳遞給通道的門控結(jié)構(gòu)，連接片段的長度會影響這個力的傳遞。進(jìn)一步研究認(rèn)為，STREX插入體對于BK機械敏感性至關(guān)重要[3]，去除STREX或?qū)⑵渲械奶K氨酸(第674位)替換為丙氨酸可以徹底消除雞胚心肌來源的BK對牽張刺激的反應(yīng)。因此，認(rèn)為BK所接受的應(yīng)力來源于STREX第674位氨基酸與細(xì)胞膜某個未知結(jié)構(gòu)的相互作用， STREX片段從膜上吸收機械能并通過C端連接片段傳遞給通道的激活門。小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞BK的α亞基缺乏STREX序列，但是仍具有機械敏感性[2,5]。這提示可能還有其他結(jié)構(gòu)調(diào)控BK對機械刺激的感受。分析以上研究實驗條件的異同發(fā)現(xiàn)，在小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上除表達(dá)不含STREX序列的α亞基，還同時表達(dá)β1亞基。β1亞基在調(diào)節(jié)BK的鈣敏感性和電壓敏感性中的重要作用均已得到證實[10-11]，BK對機械刺激的感受是否也有可能受β1亞基的調(diào)節(jié)，這一假設(shè)值得進(jìn)一步研究證實。

細(xì)胞骨架是由微管、微絲、中間絲蛋白相互交織所形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞骨架系統(tǒng)不僅在維持平滑肌細(xì)胞形態(tài)、參與收縮活動中發(fā)揮作用，還與胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、胞內(nèi)物質(zhì)的運輸以及細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運等方面有關(guān)，同時還對膜離子通道的錨定和功能有重要的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞松弛素B是一種促進(jìn)微絲解聚的藥物，它在細(xì)胞內(nèi)與微絲的正端結(jié)合，并引起F-肌動蛋白解聚，阻斷G-肌動蛋白的聚合。已經(jīng)有許多實驗證實細(xì)胞骨架特別是肌動蛋白在介導(dǎo)機械刺激的過程中起了關(guān)鍵的作用。Guharay等[12]在研究骨骼肌牽張激活離子通道時，曾經(jīng)應(yīng)用細(xì)胞松弛素B 降解肌動蛋白網(wǎng)架，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通道的活動明顯增加。

本研究結(jié)果顯示，在同一膜片應(yīng)用細(xì)胞松弛素B后，BK通道的背景活動和在每一壓力下的NPo較加藥前有所增加，加藥后NPo與壓力的半對數(shù)關(guān)系曲線雖有上移，但是與加藥前基本平行，提示通道的機械敏感性并未改變，BK的機械敏感性的門控機制符合膜模型。細(xì)胞骨架對消化道平滑肌上BK的機械敏感性的調(diào)節(jié)特點與心肌上KATP通道相類似[9]：作為通道力學(xué)微環(huán)境的重要成分，內(nèi)襯于細(xì)胞膜的細(xì)胞皮質(zhì)骨架可能作為細(xì)胞膜的并聯(lián)成分承受部分細(xì)胞應(yīng)力，使脂質(zhì)膜的應(yīng)力減少，從而保護(hù)通道免受過多的機械刺激，避免BK被過度激活。在膜內(nèi)向外記錄模式下，當(dāng)向膜片施加負(fù)壓刺激時，加載在膜片上的負(fù)壓由膜脂質(zhì)部分的應(yīng)力和膜下皮質(zhì)骨架的應(yīng)力共同分擔(dān)，而降解肌動蛋白骨架勢必增加膜上的張力從而增加通道的背景NPo和對機械刺激的反應(yīng)。

有關(guān)BK的機械敏感性機制的研究，不僅可以豐富機械敏感離子通道的門控機制的理論知識，并將為揭示平滑肌張力的肌源性調(diào)節(jié)機制和從機械信號感受的視角研究胃腸功能障礙奠定基礎(chǔ)，為消化道運動功能紊亂的防治開辟嶄新的領(lǐng)域。(本文圖見封二)

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(本文編輯：趙麗潔)

Effects of actin on mechanosensitivity of large conductance calcium-activated potassium channels in colonic smooth muscle cells

HUANG Hai-xia,HOU Dong-yan,XIN Fang,REN Jie,LIU Ping，WANG Wei*

(Department of Physiology and Pathophysiology, the School of Basic Medical Sciences,Capital Medical University, Beijing 100069, China)

Objective To study the relationship between the mechanosensitivity of large conductance calcium-activated potassium channels(BK) and actin.Methods The messenger ribonucleic acid(mRNA) of BK α- and β- subunits were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) technique. BK single channel activities in mice colonic smooth muscle cells were recorded with patch-clamp technique and the mechanosensitivity was characterized. Then, cytochalasin B was used to break down actin to determine effects of actin on mechanosensitivity of BK.Results The BK in mice colonic smooth muscle cells was composed of α- and β1-subunits. The open probability of BK in colonic smooth muscle cells increased significantly and pressure-dependently under the stimulation of negative pressure. Breaking down actin did not affect BK mechanosensitivity.Conclusion BK in mice colonic smooth muscle cells was sensitive to mechanical stimuli and its activity was intensity-dependent. It was proven that mechanosensitivity of BK did not depend on the integrity of actin. The cortical actin, which lines parallel to bilayer, shares a proportion of membranous tension and protects BK from excess stretching.

large-conductance calcium-activated potassium channels；actins；myocytes, smooth muscle

2015-10-21；

2015-11-05

國家自然科學(xué)基金(31171105)；北京市教育委員會科技發(fā)展計劃項目(SQKM201210025001)

黃海霞(1975-)，女，山東青島人，首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事離子通道研究。

*通訊作者。E-mail：wangwei@ccmu.edu.cn

R329.24

A

1007-3205(2015)11-1245-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.002