趙文龍 ，文鵬程，趙 鵬，楊秀環(huán)，程柏叢，陳 余，何 誠

鏈格孢霉（Alternaria alternata）是污染食物和飼料真菌之一，廣泛分布于泥土和植物里,包括谷物、蔬菜、水果以及田間作物。1984 年對河南省8 個縣的糧食真菌做了分離培養(yǎng)，鏈格孢霉的檢出率高達82.2%，并且食管癌高發(fā)區(qū)與低發(fā)區(qū)有非常顯著性差異[1]。鏈格孢霉對動植物的毒性作用已有報道，如20 世紀40 年代俄國曾發(fā)生發(fā)霉谷物引起的中毒事件，從食用發(fā)霉谷物里分離出多種鏈格孢霉。用從煙草里分離出的長柄鏈格孢（Alternaria longipes）的產(chǎn)毒培養(yǎng)物喂飼雛雞，結(jié)果出現(xiàn)食欲不振、昏睡、腹瀉、肌無力和昏迷，4～8 d 出現(xiàn)死亡，培養(yǎng)物導致33%的雛雞死亡，存活雞只發(fā)育嚴重遲緩。病理檢查發(fā)現(xiàn)肌胃出血和潰瘍[1]。鏈格孢霉污染谷物喂飼雛雞，3 d 后出現(xiàn)腹瀉、行動遲緩以及出血癥候群引起的衰竭直至死亡，第4 天全部死亡[2]。此外，青霉菌也是主要谷物飼料產(chǎn)毒真菌之一，可產(chǎn)生青霉酸、桔青霉素，動物吃了污染飼料會因其產(chǎn)生大量的毒素對動物機體造成危害[3]。

北京某乳鴿場2013 年11 月至2014 年4 月，4 000 對肉種鴿出現(xiàn)持續(xù)性腹瀉和呼吸困難，種鴿死亡率不足10%。15～23 日齡的乳鴿呈現(xiàn)張嘴喘式呼吸，發(fā)病率為80%～100%，累計死亡率高達90%。剖檢見發(fā)病乳鴿、種鴿胸部、腹部氣囊出現(xiàn)大量干酪樣滲出物，肺臟、胰腺出現(xiàn)大量白色突起結(jié)節(jié)。

為了查清種鴿場的發(fā)病原因，分別取發(fā)病乳鴿、種鴿的肺臟組織進行了真菌和細菌培養(yǎng)。同時，取乳鴿主要飼料原料-玉米進行真菌培養(yǎng)。對培養(yǎng)的細菌和真菌進行鑒別，利用培養(yǎng)獲得的真菌培養(yǎng)物分別通過口服途徑接種9 日齡和25日齡健康A(chǔ)A肉雞，進一步復制臨床病理變化。同時，對種鴿場飼料原料、免疫程序進行調(diào)整，探討防治種鴿高死亡病癥的效果。

1 材料

1.1 動物與飼料 25 日齡乳鴿和325 日齡種鴿，來自北京懷柔縣某發(fā)病的種鴿場；9 日齡、25 日齡AA肉雞和雛雞飼料，購自北京華都肉雞公司。

1.2 設備 TDL5000B型低速冷凍多管離心機，上海安寧科學儀器廠；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 培養(yǎng)基 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基和血液培養(yǎng)基，批號：20081006，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

2 方法

2.1 剖檢和分離培養(yǎng) 25 日齡死亡乳鴿10 只，325日齡發(fā)病種鴿5 只，進行剖檢。重點檢查呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的病理學變化。同時，無菌取乳鴿、種鴿肺臟組織、肝臟組織接種馬丁瓊脂培養(yǎng)基和血液培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～72 h。

2.2 飼料前處理和培養(yǎng) 定量稱取乳鴿發(fā)病期間使用玉米1 g，玉米破碎后加入30 mL 75%酒精浸泡1 h，1 000 r/min 離心10 min，取玉米沉渣放置在無菌培養(yǎng)皿中，加入改良馬丁瓊脂20 mL，25 ℃培養(yǎng)24～72 h 后，觀察真菌生長特點。

2.3 細菌和真菌的鑒定 取改良馬丁瓊脂平板上典型的真菌菌絲，放置在載玻片上，滴加1 滴1%氫氧化鈉溶液進行涂片，在顯微鏡下鏡檢。此外，選取血液培養(yǎng)基上的典型單個白色菌落送中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細菌室進行鑒定。鑒定后的典型菌落提取DNA，以16SrRNA為引物進行擴增，PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)入質(zhì)粒后進行測序[4]。

2.4 動物回歸試驗 9 日齡肉雞接種試驗：將72 h 的2 種特征性的菌絲（Ⅰ型和Ⅱ型）用1 mL 的無菌生理鹽水沖洗，再用生理鹽水進行稀釋至含有1×108個分生孢子/mL。將9 日齡20 只健康肉雞分成4 組：A組5 只，喉頭接種真菌培養(yǎng)物Ⅰ型；B組5 只，喉頭接種真菌培養(yǎng)物Ⅱ型；C組5 只，喉頭同時接種真菌培養(yǎng)Ⅰ、Ⅱ型；對照組5 只，接種等量的生理鹽水。接種后，每天對雞群進行臨床觀察，連續(xù)觀察10 d。死亡的雞進行剖檢記錄。

25 日齡肉雞接種試驗：將真菌培養(yǎng)物Ⅰ型喉頭接種5 只25 日齡肉雞，對照組接種同等劑量的生理鹽水，接種后觀察同上。

2.5 綜合防治措施 針對乳鴿飼料霉變問題，徹底更換無霉變的玉米。同時，對收購的玉米進行批次檢驗，拒絕收購霉變飼料；在鴿子飲水中添加好利高（10%牛至油），劑量為每1 000 只乳鴿添加250 mL，種鴿添加500 mL，連續(xù)10 d。對于大群中持續(xù)性呼吸困難的種鴿260 對，實施撲殺和無害化處理；針對乳鴿新城疫免疫程序進行了調(diào)整：在14 d 和25 d 進行滴鼻點眼新城疫弱毒疫苗，劑量為0.025 mL/只，免疫后按照每30 天進行定期監(jiān)測抗體變化。

3 結(jié)果

3.1 發(fā)病乳鴿和種鴿的剖檢變化 乳鴿病變主要集中在肺臟、氣囊、胰臟和肝臟上。肺臟出現(xiàn)灰白色結(jié)節(jié)樣增生物，直徑2～6 mm 不等（見中插彩版圖1）。胸部氣囊附著有大量的白色滲出物，或黃色干酪樣滲出物。胰腺表面也出現(xiàn)大小不等的灰白色結(jié)節(jié)物（見中插彩版圖2）。個別的肝臟表面出現(xiàn)小米粒樣大小的白色結(jié)節(jié)。

種鴿：肺臟和胰腺組織上附著大量的白色結(jié)節(jié)物（見中插彩版圖1-2）。胸氣囊和腹部氣囊附著大量的干酪樣滲出物。腎臟普遍腫脹，但肝臟病變不顯著。

3.2 鴿子病料和玉米分離培養(yǎng)結(jié)果 從發(fā)病乳鴿肺臟和玉米分離均獲得2 種典型的真菌菌落。

菌落Ⅰ：48 h 菌落呈羊毛至絨毛狀。72 h 菌落呈綠褐色或深褐色,背面呈黑色（見中插彩版圖3）。顯微鏡下分生孢子梗深色,直立,長短不一,不分支,頂端單生或串生呈淡褐色至深褐色,磚隔狀的分生孢子。分生孢子呈倒棍棒形、橢圓形或卵圓形,頂端有喙細胞（見中插彩版圖4）。經(jīng)過形態(tài)比對和文獻檢索，見中插彩版圖4 中的真菌屬于鏈格孢霉，又稱黑霉菌[5]。

菌落Ⅱ：菌落生長較快，呈現(xiàn)白色絮狀（見中插彩版圖5）。分生孢子梗有橫隔，光滑，基部無足細胞，分生孢子呈典型的掃帚狀（見中插彩版圖6）。

細菌分離培養(yǎng)：乳鴿肺臟和肝臟組織在血液培養(yǎng)基上同時培養(yǎng)出白色細小菌落，麥康凱培養(yǎng)基上出現(xiàn)白色小菌落。革蘭染色為陰性、大小均一的短桿菌（見中插彩版圖7）。以16SrRNA為引物進行擴增，其PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)入質(zhì)粒后進行測序，與傷寒沙門菌參考菌株08-1736（accession#CP006602.1）和參考株798（accession#CP003386.1）的相似性均為99.0%。

3.3 動物回歸試驗 9 日齡肉雞攻毒2 d 后，采食下降、精神委靡、呼吸困難（見中插彩版圖8），3 d后，A組死亡4 只。B組接種后采集食物正常，無臨床和無死亡發(fā)生。C組死亡3 只，臨床表現(xiàn)與A組相同。對上述死亡的雛雞進行剖檢發(fā)現(xiàn)：氣囊渾濁，肺臟呈現(xiàn)局灶性的出血，肺臟表面附著白色的結(jié)節(jié)，支氣管出血，腹氣囊上也見少量的白色結(jié)節(jié)（見中插彩版圖9）。從肺臟中也分離出鏈格孢霉和青霉菌。

25 日齡肉雞：接種后3 天，呈現(xiàn)喘式呼吸癥狀，未見有死亡。第7 天剖檢后，胸氣囊附著大量的白色滲出物，肺臟表面也出現(xiàn)白色的結(jié)節(jié)物。培養(yǎng)后分離出典型的鏈格孢霉。

3.4 采取綜合措施后的防治效果 徹底更換霉變的玉米，飲水中添加好利高（10%牛至油）和硫酸銅溶液（0.05%），連續(xù)10 d。此外，難以治愈的種鴿堅決淘汰，種鴿群發(fā)病率顯著下降，乳鴿發(fā)病率和死亡率控制在10%，出欄乳鴿的存活率達到92%，出欄體重也達到了上市的要求。

4 討論

4.1 鏈格孢霉和青霉菌在乳鴿高死亡率發(fā)病中作用探討 本試驗中從發(fā)病鴿子肺臟和飼料中分離獲得的鏈格孢霉和青霉菌，隨后在肉雞發(fā)病試驗中，發(fā)現(xiàn)鏈格孢霉單獨感染組、鏈格孢霉與青霉菌混合感染組均復制出了相似的臨床呼吸困難癥狀和病理學變化。從肺臟病變中分離獲得了鏈格孢霉和青霉菌。但是，青霉菌單獨接種后肉雞未出現(xiàn)死亡和典型的肺臟結(jié)節(jié)性病變。這顯示鏈格孢霉是主要的致病性真菌，青霉菌屬于條件性致病菌。鏈格孢霉污染可能在乳鴿頑固性肺炎和高死亡率中發(fā)揮主要作用。

本次乳鴿真菌病與以往報道煙曲霉感染蛋雞的報道有所區(qū)別[6]。本次發(fā)病主要侵害氣囊、肺臟、胰腺組織，其次是腎臟組織。而煙曲霉感染家禽后不但侵害肺臟、氣囊、腎臟，而且侵害肝臟組織，造成肝硬化。但是鏈格孢霉和煙曲霉均能引起持續(xù)性發(fā)作性的呼吸困難和死亡。以往鏈格孢霉感染雛雞死亡率達到33%，本次乳鴿的死亡率高達90%。肉雞回歸試驗中死亡率達到80%，這說明鏈格孢霉造成的危害性大于煙曲霉的感染。煙曲霉感染主要侵害10 日齡左右的雛雞，大于20 日齡的雛雞發(fā)病率降低。本次鏈格孢霉感染25 日齡回歸試驗，復制出了臨床呼吸道病癥狀，未見有死亡出現(xiàn)，這可能與觀察時間短有關(guān)。但是本次發(fā)病種鴿出現(xiàn)10%的死亡，這也說明鏈格孢霉具有較高的致病性。Christensen 等用從食物和飼料里分離到的鏈格孢霉、曲霉、青霉和鐮刀菌的培養(yǎng)物喂飼大鼠，鏈格孢霉、鐮刀菌、曲霉菌、青霉菌的培養(yǎng)物造成死亡率分別為78%、61%、43%和7%[7]。這說明鏈格孢霉污染飼料造成的損失超過曲霉菌、青霉菌和鐮刀菌。此外，本次乳鴿肺臟和肝臟組織中均分離出傷寒沙門菌，懷疑病鴿霉菌感染后機體抵抗力下降，產(chǎn)生免疫抑制，繼發(fā)了沙門菌病的進一步感染[8]。

4.2 乳鴿鏈格孢霉感染的主要原因 據(jù)美國1984 年的谷物污染調(diào)查，230 份麥類樣品中，鏈格孢霉侵染率達77%，268 株鏈格孢霉菌株中有101株產(chǎn)毒素，鏈格孢霉主要通過污染小麥，造成肌胃潰瘍和腹瀉[1]。但是玉米中污染鏈格孢霉造成家禽的發(fā)病尚未見報道。本次從乳鴿、種鴿的飼料原料玉米中分離獲得了鏈格孢霉和青霉菌，且現(xiàn)場檢查40%～50%玉米的胚芽出現(xiàn)褐色斑塊。種鴿通過哺乳喂養(yǎng)給乳鴿，鏈格孢霉隨鴿乳進入幼鴿消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)，導致氣囊和肺臟感染。種鴿感染鏈格孢霉后，通過產(chǎn)生毒素，引起氣囊、肺臟滲出性炎癥，形成氣囊纖維素性病變和結(jié)節(jié)性病變，由于呼吸性衰竭而被迫淘汰。

4.3 鏈格孢霉病防治的措施分析 定期對飼料原料進行真菌培養(yǎng)和分析，杜絕發(fā)霉飼料用于乳鴿和種鴿飼養(yǎng)。其次，采取人工鴿乳方式對乳鴿進行哺育，切斷種鴿真菌病和沙門菌病向乳鴿傳播，減少發(fā)病的風險。同時，針對種鴿沙門菌感染問題，采取定期檢測和診斷，淘汰陽性種鴿群，杜絕垂直傳播，保證乳鴿食品衛(wèi)生安全。

5 結(jié)論

通過病原分離、鑒定和動物回歸試驗證明鏈格孢霉感染可以造成乳鴿、種鴿結(jié)節(jié)性肺炎和乳鴿的高死亡率。玉米飼料污染大量的鏈格孢霉是發(fā)病的主要因素，養(yǎng)殖企業(yè)也要高度重視鏈格孢霉污染飼料后的危害性。

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