黃 艷，李曉慧，吳正升，王 歡，汪應(yīng)紅，李海迪，孫仕偉，李 俊

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白Caspase-12在四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型中的作用研究

黃 艷1，2，李曉慧1，2，吳正升3，王 歡1，2，汪應(yīng)紅1，2，李海迪1，孫仕偉1，李 俊1，2

目的探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）標(biāo)志性蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶12（Caspase-12）在大鼠肝纖維化形成與逆轉(zhuǎn)恢復(fù)病程中的作用。方法建立四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，蘇木精－伊紅染色和Masson膠原纖維染色觀察肝臟病理組織學(xué)改變；免疫組化法檢測(cè)肝組織肝纖維化標(biāo)志性蛋白α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）以及鈣激活蛋白酶（Calpain）的表達(dá)；Western blot檢測(cè)不同時(shí)期肝臟組織中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)變化。結(jié)果肝臟病理組織學(xué)檢測(cè)提示肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型成功。免疫組化結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織中α-SMA和Calpain抗原陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多、著色明顯加深，且多分布在肝實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞區(qū)域。逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期，α-SMA抗原表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞與模型組比較逐漸下降。Calpain抗原表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在肝臟的小葉中央靜脈、匯管區(qū)、肝竇間隙等部位。Western blot結(jié)果顯示，模型組肝臟Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)與正常組相比顯著升高。與模型組相比，逆轉(zhuǎn)恢復(fù)2、4和8周組肝組織Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)降低，但仍高于正常組。結(jié)論 ERS標(biāo)志性蛋白Caspase-12誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡存在于大鼠肝纖維化病程中，可能與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展和恢復(fù)逆轉(zhuǎn)密切相關(guān)。

肝纖維化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；凋亡；Calpain；Caspase-12

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是繼死亡受體活化和線粒體損傷之后第3條介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。ERS誘導(dǎo)的3條主要凋亡通路為CHOP／GADD153基因的激活通路、氨基末端蛋白激酶（c-jun NH2-terminal protein kinasec-jun，JNK）激活通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的Caspase-12激活通路。目前研究［1－2］表明多種肝臟疾病的發(fā)生與Caspase-12介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。但Caspase-12介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否存在于肝纖維化的進(jìn)展、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期中，其作用如何尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)建立在四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型基礎(chǔ)上，觀察ERS標(biāo)志性蛋白Caspase-12在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期中的變化及其可能作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50只雄性SD大鼠，SPF級(jí)，180～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑CCl4購(gòu)自汕頭西隴化工廠；細(xì)胞組織裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF購(gòu)自上海碧云天公司；毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）、衣霉素（tunicamycin，TN）、丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Cleaved-Caspase-3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司；Cleaved-Caspase-12抗體購(gòu)自美國(guó)Biovision公司；Calpain和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記抗兔和抗鼠免疫球蛋白（immunoglobin G，IgG）購(gòu)自北京中杉金橋公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與模型建立 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)2周組、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)4周組和逆轉(zhuǎn)恢復(fù)8周組，每組10只。除正常組外，每組大鼠按1 ml／kg皮下注射CCl4溶液（按體積比CCl4：花生油＝1∶1），一周2次，共12周。正常組以相同方法注射等量花生油作對(duì)照。模型組、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)2周組、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)4周組、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)8周組分別于造模結(jié)束后第0、2、4、8周分批處死大鼠，取肝組織樣本迅速冷凍保存。

1.3.2病理學(xué)檢查 肝組織用10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，做常規(guī)組織切片，蘇木精－伊紅（HE）染色和Masson膠原纖維染色，鏡下觀察并比較不同時(shí)期組織的病理變化。

1.3.3免疫組化檢測(cè)肝組織α-SMA和Calpain蛋白表達(dá) 大鼠肝組織用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片。采用SP法染色，切片常規(guī)脫蠟，加50 μl過(guò)氧化酶阻斷溶液，室溫孵育15 min；PBS沖洗后加0.1%的胰蛋白酶消化20 min，加50 μl非免疫性動(dòng)物血清，室溫下孵育10 min；加50 μl的一抗，4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗后加50 μl生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30 min；再加50 μl鏈霉菌抗生素蛋白－過(guò)氧化物酶溶液，室溫下孵育30 min；DBA顯色、蘇木精復(fù)染、封片觀察。

1.3.4Western blot法檢測(cè)肝組織Calpain、Cleaved-Caspase-12、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá) 取經(jīng)處理后的肝組織，加500 μl RIPA細(xì)胞裂解液、5 μl PMSF于冰上裂解30 min后4℃、12 000 r／min離心30 min。取上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜上。用5%的脫脂牛奶封閉3 h后，與1∶500一抗4℃孵育過(guò)夜。再與1∶5 000的HRP標(biāo)記的IgG室溫孵育1 h，ECL顯色，Quantity One軟件測(cè)定分析結(jié)果。采用β-actin作為內(nèi)參照，分別以相應(yīng)蛋白與β-actin光密度比值表示該蛋白相對(duì)表達(dá)水平。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理變化HE染色及Masson膠原纖維染色結(jié)果顯示正常組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列成肝索狀；模型組可見大量膠原纖維沉積于小葉中央靜脈、匯管區(qū)、肝竇間隙等部位形成纖維間隔及假小葉，并伴有大量脂肪空泡。停止注射CCl4，經(jīng)2、4、8周，可見大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)中脂肪空泡逐漸減少，纖維間隔逐漸變窄，纖維沉積程度逐漸減輕，提示CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化以及逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型成功。見圖1。

2.2 肝纖維化不同時(shí)期肝組織中α-SMA和Calpain蛋白表達(dá) 免疫組化法檢測(cè)α-SMA和Calpain蛋白在肝纖維化大鼠不同時(shí)期肝組織中的表達(dá)，陽(yáng)性染色細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒。結(jié)果顯示正常組大鼠肝臟組織中α-SMA和Calpain抗原陽(yáng)性表達(dá)較少，模型組大鼠肝臟組織中α-SMA和Calpain抗原陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多、著色明顯加深，且多分布在肝實(shí)質(zhì)區(qū)域。逆轉(zhuǎn)恢復(fù)2、4、8周組中，α-SMA、Calpain抗原表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞與模型組比較，隨著逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期時(shí)間延長(zhǎng)，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量及程度逐漸下降，Calpain抗原表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在肝臟的小葉中央靜脈、匯管區(qū)、肝竇間隙等部位，與肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）大致位置相同。提示肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期表達(dá)α-SMA的活化的HSCs逐漸減少，肝細(xì)胞凋亡減少。見圖2。

2.3 Western blot法檢測(cè)不同時(shí)期肝組織中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)與正常組大鼠肝臟組織相比，模型組大鼠肝臟組織中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增多；而與模型組相比，肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)2、4、8周組中，Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見圖3。

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制與肝細(xì)胞大量凋亡和靜止的HSCs活化增殖，合成大量膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過(guò)度沉積引起［3］。因此，抑制肝細(xì)胞壞死凋亡和促進(jìn)活化的HSCs凋亡，有助于肝纖維化的逆轉(zhuǎn)恢復(fù)［4］。

研究［5－7］表明ERS在肝纖維化的進(jìn)展期抑制HSCs活化，在肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期促進(jìn)活化的HSCs凋亡。研究［8］顯示HSCs與ERS誘導(dǎo)劑TG或TN體外共培養(yǎng)，CHOP、JNK和Caspase-12的表達(dá)明顯變化，其可能與逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期ERS誘導(dǎo)活化HSCs凋亡增加密切相關(guān)。

有研究［9－10］表明，當(dāng)ERS激活時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將儲(chǔ)存的Ca2＋釋放到細(xì)胞胞質(zhì)中與鈣離子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而激活Calpain。細(xì)胞質(zhì)鈣活化蛋白導(dǎo)致的鈣外流的刺激，裂解并且激活Caspase-12，啟動(dòng)下游的凋亡路徑Caspase-3，發(fā)生凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)［11－12］。本實(shí)驗(yàn)建立CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型，采用HE染色、Masson膠原纖維染色驗(yàn)證模型成功。免疫組化法檢測(cè)α-SMA和Calpain蛋白在大鼠肝組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，隨著恢復(fù)期時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠肝組織中α-SMA和Calpain陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量及程度逐漸下降提示HSCs活化降低；而Calpain抗原表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在肝臟的小葉中央靜脈、匯管區(qū)、肝竇間隙等部位，與HSCs細(xì)胞的大致位置相同，提示Ca2＋依賴性Calpain活化可能參與Caspase-12誘導(dǎo)的大鼠HSCs凋亡。Western blot法結(jié)果進(jìn)一步表明，模型組大鼠肝臟組織中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)較正常組明顯增多；而肝纖維化恢復(fù)期2、4、8周組中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果：模型組Cleaved-Caspase-12表達(dá)顯著上升，提示Caspase-12誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡參與肝纖維進(jìn)展期；在肝纖維化逆轉(zhuǎn)復(fù)期，Cleaved-Caspase-12在活化HSCs中表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)活化HSCs凋亡增加，但其整體表達(dá)水平逐漸下降，提示其誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡顯著降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ERS存在于大鼠肝纖維化病程中，其可能參與肝細(xì)胞和HSCs增殖活化、凋亡的調(diào)控，與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展和逆轉(zhuǎn)恢復(fù)密切相關(guān)。

［1］ De Minicis S，Candelaresi C，Agostinelli L，et al.Endoplasmic Reticulum stress induces hepatic stellate cell apoptosis and contributes to fibrosis resolution［J］.Liver Int，2012，32（10）：1574－84.

［2］ Liu Y，Wang J，Qi S Y，et al.Reduced endoplasmic reticulum stress might alter the course of heart failure via caspase-12 and JNK pathways［J］.Can J Cardiol，2014，30（3）：368－75.

［3］ Lin J，Wu J F，Zhang Q，et al.Virus-related liver cirrhosis：molecular basis and therapeutic options［J］.World J Gastroenterol，2014，20（21）：6457－69.

［4］ Liu H，Li J，Huang Y，et al.Inhibition of transient receptor potential melastain 7 channel increases HSCs apoptosis induced by TRAIL［J］.Life Sci，2012，90（15－16）：612－8.

［5］ 李曉慧，李 俊，黃 艷，等.TRAIL通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)肝星狀細(xì)胞凋亡的調(diào)控及部分機(jī)制的研究［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（7）：863－7.

［6］ 謝加力.ERS與TRAIL在大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡中的相互關(guān)系探討［D］.合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2012.

［7］ 謝加力，李 俊，黃 艷，等.大鼠肝纖維化進(jìn)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)變化研究［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（9）：1028－32.

［8］ Huang Y，Li X，Wang Y，et al.Endoplasmic reticulum stress-induced hepatic stellate cell apoptosis through calcium-mediated JNK／P38 MAPK and Calpain／Caspase-12 pathways［J］.Mol Cell Biochem，2014，394（1－2）：1－12.

［9］ Kim do Y，Chung S I，Ro S W，et al.Combined effects of an antioxidant and caspase inhibitor on the reversal of hepatic fibrosis in rats［J］.Apoptosis，2013，18（12）：1481－91.

［10］Zhu Y，Men R，Wen M，et al.Blockage of TRPM7 channel induces hepatic stellate cell death through endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis［J］.Life Sci，2014，94（1）：37－44.

［11］Mu Y，Liu P，Du G，et al.Action mechanism of Yi Guan Jian Decoction on CCl4induced cirrhosis in rats［J］.J Ethnopharmacol，2009，121（1）：35－42.

［12］Mazumdar B，Meyer K，Ray R.N-terminal region of gelsolin induces apoptosis of activated hepatic stellate cells by a caspase-dependent mechanism［J］.PLoS One，2012，7（8）：e44461.

Effect of endoplasmic reticulum stress protein caspase-12 in carbon tetrachloride-induced reversible liver fibrosis in rats

Huang Yan1，2，Li Xiaohui1，2，Wu Zhengsheng3，et al
（1School of Pharmacy，2Institute for Liver Diseases，3Dept of Pathology，Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo detect the effect of endoplasmic reticulum stress（ERS）-related protein Caspase-12 in rat liver fibrosis and spontaneous reversal process.MethodsLiver fibrosis model was induced by CCl4in rats，the protein expressions of Calpain and α-SMA were detected by immunohistochemical staining.The protein expressions of Calpain，Cleaved-Caspase-12 and Cleaved-Caspase-3 in liver tissue were measured by Western blot.ResultsImmunohistochemistryResultsshowed that compared with the normal group，α-SMA and calpain antigen-positive cells of rat liver tissue in model group were significantly increased，distributing in liver parenchymal area.Compared with model group，in recovery model，α-SMA antigen-positive cells decreased.Calpain antigen-positive cells were mainly distributed in the liver lobule central vein，portal area，sinusoidal gap and other parts.Western blotResultsshowed that compared with the control group，expressions of Calpain，Cleaved-Caspase-12 and Cleaved-Caspase-3 were significantly enhanced in the model group.Compared with the model group，expressions of Calpain，Cleaved-Caspase-12 and Cleaved-Caspase-3 were decreased in spontaneous recovery after 2，4 and 8 weeks.ConclusionERS-related protein Caspase-12 might be related to the progression and regrossion of liver fibrosis.

liver fibrosis；endoplasmic reticulum stress；apoptosis；Calpain；Caspase-12

R 575.2

1000－1492（2015）02－0140－04

2014－12－12接收

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81102493、30873081）；國(guó)家教育部博士點(diǎn)新教師基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：20103420120001）；安徽醫(yī)科大學(xué)國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201310366030）

安徽醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院基礎(chǔ)與臨床藥理教研室、2肝病研究所，合肥 2300323安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，合肥230022

黃 艷，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師；李 俊，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lijun＠ahmu.edu.cn