袁永豐曾 亮

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210046）

·研究報告·

復(fù)方薤白膠囊對慢性阻塞性肺疾病大鼠模型氣道重塑作用的研究*

袁永豐1曾 亮2△

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210046）

目的觀察復(fù)方薤白膠囊對慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠氣道重塑作用的影響。方法120只大鼠采用隨即機(jī)表分為正常對照組、模型組及復(fù)方薤白治療組3組，氣管注射脂多糖及熏香煙聯(lián)合造模方法制備COPD大鼠模型。正常對照組、模型組灌胃10 mL/kg純凈水，復(fù)方薤白治療組灌胃給予復(fù)方薤白膠囊混懸液（38 g/mL），連續(xù)14 d。光鏡下觀察大鼠病理學(xué)改變；免疫組化法測量支氣管-肺組織中TIMP-1、MMP-9蛋白陽性表達(dá)面積比率。結(jié)果模型組支氣管纖毛上皮部分脫落，纖毛粘連倒伏、變性、壞死，氣道上皮復(fù)層化，杯狀上皮細(xì)胞增生；支氣管平滑肌厚度明顯增加，管腔內(nèi)有中度滲出物；氣管黏膜下層、肌層可見大量嗜酸性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及少量漿細(xì)胞浸潤。復(fù)方薤白治療組支氣管纖毛輕度粘連倒伏、變性，杯狀上皮細(xì)胞輕度增生，支氣管平滑肌厚度輕度增加，管腔內(nèi)無滲出物；氣管黏膜下層、肌層可見少量嗜酸性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及少量漿細(xì)胞浸潤。與正常對照組比較，模型組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度、MMP-9、TIMP-1陽性細(xì)胞平均面積、累積光密度、光密度均高于正常對照組（均P＜0.05）。與模型組比較，復(fù)方薤白治療組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度、MMP-9、TIMP-1陽性細(xì)胞平均面積、累積光密度、光密度則低于模型組 （均P＜0.05）。結(jié)論復(fù)方薤白膠囊可以有效減輕COPD支氣管壁及平滑肌增厚，有效降低COPD大鼠支氣管-肺組織TIMP-1、MMP-9的分布及表達(dá)，抑制COPD大鼠模型的氣道重塑，延緩COPD的發(fā)展。

COPD 大鼠模型 氣道重塑 復(fù)方薤白膠囊

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）病理改變是肺組織慢性炎癥導(dǎo)致不正常的反復(fù)損傷、修復(fù)，逐漸出現(xiàn)氣道重構(gòu)和氣流阻塞［1-3］，是慢性呼吸系統(tǒng)疾病主要死因［4］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病病機(jī)是痰瘀互結(jié)，阻于肺絡(luò)，閉郁氣道，即COPD氣道重塑的中醫(yī)病機(jī)［5］。復(fù)方薤白膠囊具有通陽宣痹、理氣化痰、止咳平喘之功，前期臨床實踐證明復(fù)方薤白膠囊對改善COPD患者咳嗽、咯痰、喘息等癥狀、體征有明顯療效［6］。本研究通過觀察各實驗組大鼠肺組織病理變化及MMP-9、TIMP-1細(xì)胞因子的分布表達(dá)，觀察復(fù)方薤白膠囊干預(yù)下COPD的氣道重塑情況?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性Wister清潔級大鼠120只（合格證號0006891），體質(zhì)量（200±20）g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于二級動物實驗室，10只/籠。稱量體質(zhì)量后，按隨即機(jī)表分為正常對照組、模型組、復(fù)方薤白治療組3組。

1.2 藥物及試劑 復(fù)方薤白膠囊由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院提供（批號100330）。地塞米松（天津藥業(yè)焦作有限公司生產(chǎn)，批號10051411）。脂多糖（LPS）由美國Sigma公司提供（批號20100729）。大前門牌香煙（南京卷煙廠生產(chǎn)，焦油含量12 mg/支）。

1.3 COPD大鼠模型制備 應(yīng)用香煙熏吸加氣管內(nèi)注入LPS法建立COPD模型。大鼠在第1日和第14日采用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，將其固定于解剖臺上，頭低位，暴露聲門，將18號靜脈套管針快速插入氣管，拔出針芯，用1 mL注射器1 s鐘內(nèi)注入溶于 0.9%氯化鈉注射液的脂多糖 0.2 mL（200 μg/μL），然后將大鼠直立左右旋轉(zhuǎn)，使脂多糖能夠均勻分布于兩肺。第2～28日（第14日除外）將大鼠分組置入自制密閉造模箱內(nèi)，給予大鼠每天上午香煙煙熏30 min，每次4支香煙。

1.4 給藥 造模成功后各組大鼠均灌胃給藥，每日1次，灌胃容積每次20 mL，連續(xù)灌胃15 d。正常對照組，灌服0.9%氯化鈉注射液等容積灌胃，每日1次。模型組，灌服0.9%氯化鈉注射液等容積灌胃，每日1次。復(fù)方薤白治療組，將復(fù)方薤白膠囊配成38 g/mL的混懸液，給藥劑量760 mg/（kg·d）。

1.5 標(biāo)本采集及處理 實驗結(jié)束后，按4 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，股動脈放血處死大鼠，取出右肺，剪取下葉，用10%福爾馬林固定48 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、浸蠟，包埋，中性樹膠封片。

1.6 觀察指標(biāo) 1）支氣管形態(tài)學(xué)檢測。400倍光學(xué)顯微鏡下挑選3支有完整橫斷面的中小支氣管，分析測量基底膜周徑（Pbm）、支氣管總面積（Wat1）、管腔面積（Wat2）、平滑肌外緣內(nèi)氣管面積（Wam1）、平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積（Wam2）。隨機(jī)取HE切片中直徑100～200 μm較規(guī)整的小支氣管橫截面，測量其支氣管管壁厚度以及管壁內(nèi)周長。按評分表評價小氣道重塑的情況。2）小氣道MMP-9、TIMP-1的免疫組化測定。免疫組化染色結(jié)果經(jīng)顯微圖像分析，在顯微鏡400倍視野下，每張切片分別從四周和中間隨機(jī)選取5個視野，測定肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)顆粒的吸光度，取其平均值作為該只大鼠MMP-9、TIMP-1的蛋白表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，在利用Dunnett-t檢驗進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠支氣管-肺組織病理學(xué)改變 模型組支氣管纖毛上皮部分脫落，纖毛粘連倒伏、變性、壞死，氣道上皮復(fù)層化，杯狀上皮細(xì)胞增生；支氣管平滑肌厚度明顯增加，管腔內(nèi)有中度滲出物；氣管黏膜下層、肌層可見大量嗜酸性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及少量漿細(xì)胞浸潤。復(fù)方薤白治療組支氣管纖毛輕度粘連倒伏、變性，杯狀上皮細(xì)胞輕度增生，支氣管平滑肌厚度輕度增加，管腔內(nèi)無滲出物；氣管黏膜下層、肌層可見少量嗜酸性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及少量漿細(xì)胞浸潤。

2.2 各組大鼠支氣管壁厚度及平滑肌厚度比較 見表1。結(jié)果示，與正常對照組比較，模型組大鼠支氣管壁厚度和平滑肌厚度均高于正常對照組（P＜0.05）。與模型組比較，復(fù)方薤白治療組大鼠支氣管壁厚度和平滑肌厚度則低于模型組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠支氣管壁厚度和平滑肌厚度比較（μm2/μm，±s）

表1 各組大鼠支氣管壁厚度和平滑肌厚度比較（μm2/μm，±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別 n W a t W a m正常對照組 2 0 1 8 . 5 9 ± 3 . 7 4 4 . 2 2 ± 0 . 4 2模型組 2 0 3 6 . 0 9 ± 5 . 9 4*9 . 4 1 ± 1 . 8 0*復(fù)方薤白治療組 2 0 2 3 . 0 3 ± 2 . 2 4△4 . 9 4 ± 1 . 2 0△

2.3 各組大鼠MMP-9、TIMP-1的在小氣道上皮及肺組織中表達(dá)情況的比較 見表2，表3。結(jié)果示，與正常對照組比較，模型組MMP-9、TIMP-1陽性細(xì)胞平均面積、累積光密度、光密度均升高（P＜0.05）。與模型組比較，正常對照組、復(fù)方薤白治療組MMP-9、TIMP-1陽性細(xì)胞平均面積、累積光密度、光密度均降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠肺組織細(xì)胞因子MMP-9表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織細(xì)胞因子MMP-9表達(dá)比較（±s）

組 別 n 陽性細(xì)胞平均面積（μ m2）累積光密度 光密度正常對照組 2 0 1 2 8 . 7 6 ± 3 5 . 9 1*模型組 2 0 2 2 4 . 1 3 ± 4 7 . 7 2△1 1 . 2 6 ± 4 . 6 4*0 . 0 8 ± 0 . 0 2*3 4 . 2 4 ± 8 . 9 4△0 . 1 6 ± 0 . 0 4△復(fù)方薤白治療組 2 0 1 5 1 . 2 4 ± 3 6 . 8 7*9 . 0 1 ± 2 . 6 2*0 . 0 6 ± 0 . 0 4*

表3 各組大鼠肺組織細(xì)胞因子TIMP-1表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織細(xì)胞因子TIMP-1表達(dá)比較（±s）

組 別 n 陽性細(xì)胞平均面積（μ m2）累積光密度 光密度正常對照組 2 0 1 3 0 . 5 1 ± 4 6 . 4 0*模型組 2 0 1 8 5 . 7 8 ± 1 4 . 2 1△1 8 . 2 7 ± 8 . 8 9*0 . 1 3 ± 0 . 0 3*4 1 . 2 8 ± 1 1 . 0 2△0 . 2 2 ± 0 . 0 4△復(fù)方薤白治療組 2 0 1 2 7 . 6 5 ± 2 2 . 2 6*2 1 . 6 6 ± 5 . 4 9 0 . 1 5 ± 0 . 0 1*

3 討 論

研究證實氣道重塑是COPD的重要病理特征［7-8］，一般認(rèn)為與炎癥、氧化應(yīng)激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡及細(xì)胞凋亡等導(dǎo)致的損傷和修復(fù)有關(guān)［9-10］，對氣道組織學(xué)直接評估是評估COPD氣道重塑較準(zhǔn)確的方法［11］。本研究采用2次氣管內(nèi)注入脂多糖加煙熏復(fù)制大鼠COPD模型，通過HE染色觀察COPD大鼠支氣管-肺組織病理學(xué)改變以及氣道壁厚度顯示，模型組大鼠具有氣道炎癥、氣道重塑等病理改變，符合COPD模型的形態(tài)學(xué)和病理學(xué)改變，說明COPD大鼠模型復(fù)制成功。

復(fù)方薤白膠囊是以瓜蔞薤白白酒湯為基礎(chǔ)制成，方以薤白、瓜蔞、半夏等為主藥，具有通陽宣滯、理氣化痰、止咳平喘的功效。本研究結(jié)果表明，復(fù)方薤白膠囊對COPD大鼠肺組織的相關(guān)損傷起一定保護(hù)作用，可減輕炎癥反應(yīng)程度，并改善大鼠支氣管壁厚度及平滑肌厚度，改善COPD大鼠整體功能狀況。由此可見，復(fù)方薤白膠囊可抑制COPD大鼠小氣道炎癥基礎(chǔ)上的氣道重塑。

本研究通過免疫組化法觀察肺組織中細(xì)胞因子MMP-9、TIMP-1的分布及表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織細(xì)胞因子MMP-9表達(dá)明顯高于正常對照組。與模型對照組比較，復(fù)方薤白治療組可降低大鼠肺組織中細(xì)胞因子MMP-9、TIMP-1的分布及表達(dá)，提示復(fù)方薤白膠囊可通過降低COPD肺組織中MMP-9、TIMP-1的表達(dá)及活性，抑制氣道和肺的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、基質(zhì)膜降解，從而抑制氣道重塑。

COPD模型大鼠具有明顯的氣道炎癥及氣道壁增厚的特征［12-13］。復(fù)方薤白膠囊可以有效減輕COPD支氣管壁及平滑肌增厚，減輕組織和細(xì)胞損傷，有效抑制COPD大鼠支氣管-肺組織TIMP-1、MMP-9分布及表達(dá)，抑制COPD氣道重塑。復(fù)方薤白膠囊對COPD大鼠模型具有抗炎作用，并干預(yù)氣道重塑，能較好修復(fù)和緩解COPD模型的病理改變，延緩COPD的發(fā)展。本研究結(jié)果為臨床進(jìn)一步探索復(fù)方薤白膠囊有效抑制COPD氣道炎癥和氣道重塑提供了理論依據(jù)。

［1］ 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南［J］.中華結(jié)核與呼吸雜志，2002，25（8）：453.

［2］ Tam A，Sin DD.Pathobiologic mechanisms of Chronic Obstructive Lung Disease［J］.Med Ciln North Am，2012，96（4）：681-689.

［3］ Hung KF.The role of airway smooth muscle in the pathogenesis of airway wall remodeling in chronic obstructive pulmonary disease［J］.Proc Am Thorac Soc，2005，2（4）：347-354；discussion 371-372.

［4］ Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease（COPD）. Global strategy for the diagnosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease.2013.

［5］ 白曉旭，焦陽，王琦，等.益氣消癥方對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（6）：1974-1977.

［6］ 姜靜，奚肇慶，尚寧，等.復(fù)方薤白膠囊干預(yù)慢性阻塞性肺疾病的臨床研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，11（23）：362-364.

［7］ Pini L，Pinelli V，Modina D，et al.Central airways remodeling in COPD patients.Int J Chron Obstruct Pulmon Dis，2014 Sep 1，9：927-932.

［8］ Ganesan S，Sajjan US.Repair and remodeling of airway epithelium after injury in chronic obstructive pulmonary disease［J］.Curr Respir Care Rep，2013，2：145-154.

［9］ Perotin JM，Adam D，Vella-Boucaud J，et al.Delay of airway epithelial wound repair in COPD is associated with airflow obstruction severity［J］.Respir Res，2014 Nov 27，15（1）：151.

［10］Kwiatkowska S，Noweta K，Zieba M，et al.Enhanced exhalation of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in patients with COPD exacerbation：a prospective study［J］.Respiration，2012；84（3）：231-241.

［11］莫碧文，張貞貞，韋江紅，等.脂多糖對哮喘大鼠氣道炎癥、氣道重塑及TLR4表達(dá)的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2013，29（2）：153-157.

［12］陳寧，徐燕，張永紅，等.慢性阻塞性肺病大鼠外周血中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及IL-17、IL-6水平的變化［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2014，27（9）：24-28.

［13］楊孔軍，吳丹丹.COPD氣道重塑相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.臨床肺科雜志，2012，17（3）：510-512.

The Study of the Role on of CMOC on the Airway Remodeling in Rats with COPD

YUAN Yongfeng，ZENG liang. Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210029，China

Objective：To investigate the role of CMOC on the in airway remodeling in rats with COPD.Methods：The rat model of COPD was established by cigarette smoking combined with intratracheal injection of lipopolysaccharide（LPS）.120 rats were randomly divided into three groups：normal control group，model group and CMOC treatment group.The normal group and model group were intragastrically given the 10 mL/kg pure water，the treatment group were given CMOC by stomach（38 g/mL），for 14 consecutive days.Pathological changes were observed under light microscopy；positive expressions of MMP-9 and TIMP-1 area ratios in the bronchiallung tissue were determined using immunohistochemical method.Results：The bronchial wall and smooth muscle layer in the model group were thicker than normal group.Expression of MMP-9 and TIMP-1 in the model group were higher than normal group，the differences were statistically significant；compared with model group，the expression of MMP-9 and TIMP-1 of CMOC in treatment group were significantly decreased（all P＜0.05）.Conclusion：CMOC can effectively improve the bronchial wall and smooth muscle layer thickening，CMOC can effectively reduce the expression and distribution of MMP-9，TIMP-1，inhibit the airway remodeling of COPD rats model and delay the development of COPD.

COPD；Airway remodeling；MMP-9；TIMP-1

R285.5

A

1004-745X（2015）06-0967-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.06.011

2015-03-07）

江蘇省高校自然科學(xué)研究面上資助項目（11KJB360002）

△通信作者（電子郵箱：zengl8@126.com）