彭 戩程 光馬 軍王南下

（1.湖北省武漢市東湖醫(yī)院，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，湖北 武漢430030）

·研究報(bào)告·

丹參酮ⅡA對(duì)膿毒癥大鼠外周血CD4+T細(xì)胞調(diào)節(jié)的作用研究*

彭 戩1程 光2馬 軍2王南下2

（1.湖北省武漢市東湖醫(yī)院，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，湖北 武漢430030）

目的探討丹參酮Ⅱ A對(duì)膿毒癥大鼠外周血CD4+T細(xì)胞的作用。方法采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備膿毒癥大鼠模型（CLP），給予丹參酮Ⅱ A（Tan Ⅱ A）處理，分別于治療前及治療后24、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)取靜脈血，流式細(xì)胞儀檢測(cè)全血細(xì)胞中輔助性T細(xì)胞（Th1、Th2、Th17）；采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定血中白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。結(jié)果CLP組大鼠血清TNF-α、IL-17、IL-1水平和Th17比例明顯高于同期Sham組（P＜0.05），而TanⅡA各亞組血清TNF-α、IL-17、IL-1水平和Th17比例均低于CLP同期各亞組（P＜0.05）；CLP組大鼠血清IL-10水平和Th1/ Th2比值明顯低于Sham組（P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亞組血清IL-10水平和Th1/Th2比值高于CLP同期各亞組（P＜0.05）。結(jié)論丹參酮Ⅱ A可能通過作用于膿毒癥大鼠的外周血CD4+T細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、改善炎癥反應(yīng)的作用。

丹參酮Ⅱ A 膿毒癥 CD4+T細(xì)胞

膿毒癥是由感染因素誘發(fā)的一種全身性的炎癥反應(yīng)，并不是一種獨(dú)立疾病，而是包括免疫系統(tǒng)在內(nèi)的多系統(tǒng)共同作用的結(jié)果。促癥/抗炎失衡以及免疫功能紊亂是膿毒癥發(fā)生及發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。因此早期控制、清除炎癥因子是膿毒癥的治療關(guān)鍵［1-2］。丹參酮ⅡA（TanⅡA）是中藥丹參的有效成分之一，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能的作用［3］，但其在膿毒癥抗炎、調(diào)節(jié)免疫的臨床應(yīng)用及機(jī)理研究較少。因此，本研究觀察了丹參酮ⅡA對(duì)膿毒癥大鼠促癥/抗炎失衡以及免疫功能紊亂的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 72只SPF級(jí)雄性Sprague Dawley大鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），體質(zhì)量260~ 320 g，動(dòng)物許可證號(hào)：2008-0001。

1.2 試藥與儀器 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液 （規(guī)格2 mL∶10 mg，上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H31022558）。Elisa試劑盒測(cè)試盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。熒光標(biāo)記的單抗購(gòu)自Coalter公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀和Simul SET軟件購(gòu)自美國(guó)BD公司。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純（武漢康盛醫(yī)藥科技有限公司）。

1.3 分組與給藥 將大鼠隨機(jī)分成3組：盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)（CLP）、Tan Ⅱ A組和假手術(shù)組（Sham），每組24只，每組又再分為24、48、72 h 3個(gè)亞組，每組8只；Tan Ⅱ A組和CLP組行盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)，Sham組僅做盲腸探查術(shù)；Tan Ⅱ A組于術(shù)后腹腔注射20 mg/d的丹參酮Ⅱ A磺酸鈉注射液 （Tan Ⅱ A），Sham組和CLP組分別于術(shù)后腹腔注射等量生理鹽水，所有藥物處理連續(xù)72 h，均提供相同環(huán)境和飲食。

1.4 模型制備 采取盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)（CLP）。模型大鼠術(shù)前禁食12 h，給予10%水合氯醛（0.3 mL/kg）腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉充分后置于仰臥位，消毒腹部皮膚后于中下腹部行3 cm縱行切口打開腹腔，尋找并充分暴露出盲腸，采用3號(hào)縫合線于距盲腸末端1cm處行環(huán)形結(jié)扎，盲腸僅結(jié)扎50%以保證腸道通暢，并據(jù)結(jié)扎處3~5 mm處采用9號(hào)針頭貫穿盲腸3次，穿刺后手工擠壓出部分腸內(nèi)容物溢出于腹腔，并進(jìn)行關(guān)腹手術(shù)。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）IL-1、IL-10、IL-17和TNF-α測(cè)定。干預(yù)前和干預(yù)后24、48、72 h分別采集靜脈血，低溫高速離心處理（3000 r/min離心15 min），取上清。采用Elisa法檢測(cè)血清中的IL-1、IL-10、IL-17和TNF-α炎性因子水平，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒的說明進(jìn)行。2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T細(xì)胞。采用直接免疫熒光標(biāo)記全血溶血法流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血Th1、Th2、Th17細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清TNF-α、IL-10、IL-1測(cè)定結(jié)果比較 見表1。CLP組大鼠血清TNF-α和IL-1水平明顯高于同期Sham組（P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亞組血清TNF-α和IL-1水平低于CLP同期各亞組 （P＜0.05）；CLP組大鼠血清IL-10水平明顯低于Sham組 （P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亞組血清IL-10水平高于CLP同期各亞組（P＜0.05）。

2.2 各組血清IL-17、Th17、Th1/Th2測(cè)定結(jié)果比較見表2。CLP組大鼠血清IL-17水平和Th17比例明顯高于同期Sham組（P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亞組血清IL-17水平和Th17比例低于CLP同期各亞組 （P＜0.05）；CLP組大鼠血清Th1/Th2比值明顯低于Sham組（P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亞組血清Th1/Th2比值高于CLP同期各亞組（P＜0.05）。

表1 各組血清TNF-α、IL-10、IL-1測(cè)定結(jié)果比較（pg/mL，±s）

表1 各組血清TNF-α、IL-10、IL-1測(cè)定結(jié)果比較（pg/mL，±s）

與Sham組比較，*P＜0.05；與CLP組比較，△P＜0.05。下同。

組別時(shí)間 T N F -α S h a m組 2 4 h 2 9 . 7 ± 1 . 4（n = 8） 4 8 h 2 7 . 1 ± 1 . 3 7 2 h 2 8 . 3 ± 1 . 1 I L -1 I L -1 0 1 4 . 3 ± 1 . 5 2 3 1 . 9 ± 7 . 5 1 4 . 1 ± 1 . 2 2 2 9 . 1 ± 8 . 2 1 4 . 4 ± 1 . 0 2 3 4 . 9 ± 8 . 5 C L P組 2 4 h 2 6 5 . 6 ± 9 . 5*2 7 . 7 ± 4 . 2*1 4 5 . 1 ± 3 . 5*（n = 8） 4 8 h 3 6 . 7 ± 4 . 4*1 2 2 . 3 ± 3 . 8*3 5 9 . 8 ± 8 . 7*7 2 h 4 3 . 4 ± 3 . 2*1 0 1 . 5 ± 2 . 7*4 5 9 . 7 ± 8 . 4*T a nⅡ A組 2 4 h 1 8 . 8 ± 1 . 4*△1 8 5 . 4 ± 2 . 4*△2 1 6 . 6 ± 5 . 3*△（n = 8） 4 8 h 2 0 . 1 ± 1 . 1*△1 5 5 . 8 ± 3 . 2*△2 7 6 . 4 ± 5 . 1*△7 2 h 2 5 . 4 ± 1 . 3*△1 3 4 . 4 ± 3 . 9*△3 1 7 . 6 ± 5 . 2*△

表2 各組血清IL-17、Th17、Th1/Th2測(cè)定結(jié)果比較（±s）

表2 各組血清IL-17、Th17、Th1/Th2測(cè)定結(jié)果比較（±s）

組別 時(shí)間 T h 1 / T h 2 S h a m組 2 4 h 1 7 . 8 ± 2 . 5（n = 8） 4 8 h 1 7 . 5 ± 2 . 3 7 2 h 1 8 . 1 ± 3 . 1 I L -1 7（p g / m L） T h 1 7（%）7 . 5 ± 1 . 3 2 . 2 ± 0 . 2 7 . 8 ± 1 . 2 2 . 2 ± 0 . 2 7 . 4 ± 1 . 4 2 . 1 ± 0 . 1 C L P組 2 4 h 7 . 6 ± 1 . 1*7 7 . 7 ± 7 . 2*2 . 8 ± 0 . 2*（n = 8） 4 8 h 9 6 . 7 ± 8 . 5*3 . 7 ± 0 . 1*5 . 4 ± 0 . 7*7 2 h 1 1 5 . 4 ± 7 . 4*4 . 8 ± 0 . 2*2 . 1 ± 0 . 1*T a nⅡA組 2 4 h 4 2 . 3 ± 4 . 7*△2 . 5 ± 0 . 1*△1 4 . 3 ± 2 . 3*△（n = 8） 4 8 h 5 6 . 2 ± 5 . 0*△2 . 8 ± 0 . 2*△1 0 . 1 ± 1 . 5*△7 2 h 7 7 . 3 ± 7 . 7*△3 . 0 ± 0 . 3*△8 . 2 ± 1 . 0*△

3 討 論

膿毒癥是由感染因素誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)，是機(jī)體免疫、炎癥系統(tǒng)在內(nèi)的多系統(tǒng)共同作用的結(jié)果，已成為重癥患者最主要的死亡原因之一［4］，而到目前為止，關(guān)于膿毒癥的治療還沒有取得突破性的進(jìn)展。經(jīng)典治療的失敗使人們認(rèn)識(shí)到免疫水平的調(diào)節(jié)可能成為膿毒癥治療的突破，但目前無論是指導(dǎo)治療的免疫學(xué)指標(biāo)還是糾正免疫紊亂的手段都還處于起步階段［5］。丹參酮ⅡA是中藥丹參的有效成分之一，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能的作用，但其在膿毒癥的臨床應(yīng)用方面報(bào)道較少［3］。

TNF-α是炎性遞質(zhì)網(wǎng)絡(luò)通路中的關(guān)鍵因子，其增加可導(dǎo)致炎癥遞質(zhì)失控性釋放，IL-1能增加TNF-α的促炎作用，而IL-10是重要的免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子和抗炎遞質(zhì)，能減少TNF-α的促炎作用［6］。筆者通過對(duì)炎性遞質(zhì)網(wǎng)絡(luò)通路中的關(guān)鍵因子TNF-α、IL-1及IL-10在膿毒癥時(shí)的變化進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)CLP同期TNF-α和IL-1水平較對(duì)照組同期明顯升高，IL-10水平有明顯降低；給予Tan Ⅱ A處理的后，各亞組同期TNF-α和IL-1水平有明顯降低，而IL-10水平有明顯上升；證實(shí)了Tan Ⅱ A的抗炎作用。

CD4+T細(xì)胞是參與機(jī)體免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞之一，其亞群Th1、Th2細(xì)胞與Th17細(xì)胞分泌的各種細(xì)胞因子在機(jī)體促炎、抗炎中發(fā)揮著重要作用［7-8］。其中Th1細(xì)胞參與細(xì)胞免疫，介導(dǎo)細(xì)胞和局部炎癥的免疫應(yīng)答，而Th2細(xì)胞可刺激B細(xì)胞分泌抗體參與體液免疫，Th1/Th2的失衡可導(dǎo)致免疫抑制［9］；研究發(fā)現(xiàn)MODS過程中可出現(xiàn)Th1/Th2比值下降，表現(xiàn)為Th1細(xì)胞減少，而Th2細(xì)胞增加［10］；本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥可導(dǎo)致Th1/Th2比值下降，提示機(jī)體免疫功能紊亂，而給予Tan Ⅱ A處理后其血清Th1/Th2比值高于膿毒癥組同期各亞組，說明Tan Ⅱ A對(duì)膿毒癥時(shí)Th1/Th2的失衡有改善作用，提示其能改善膿毒癥時(shí)的機(jī)體免疫功能紊亂；Th17細(xì)胞可通過分泌IL-17誘導(dǎo)多種促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，參與機(jī)體炎性反應(yīng)［11-12］，發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用，是一種重要的促炎性細(xì)胞；本研究中CLP組大鼠血清IL-17水平和Th17比例明顯高于同期Sham組，而給予Tan Ⅱ A處理的各亞組中，其血清IL-17水平和Th17比例較CLP同期各亞組有顯著下降，提示丹參酮Ⅱ A可通過降低膿毒癥Th17細(xì)胞數(shù)量，減少血清IL-17含量來緩解其介導(dǎo)的促炎反應(yīng)。

綜上所述，隨著人們對(duì)膿毒癥病理生理改變和致病機(jī)制不斷深入地認(rèn)識(shí)，免疫功能的調(diào)理在膿毒癥治療中的重要性已經(jīng)得到重視，本研究證實(shí)丹參酮Ⅱ A能通過調(diào)節(jié)Th1、Th2以及Th17細(xì)胞和IL-17抑制膿毒癥大鼠炎癥的發(fā)展。

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Effect of Tanshinone Ⅱ A on Peripheral Blood CD4+T Cells in Rats with Sepsis

PENG Jian，CHENG Guang，MA Jun，et al.Wuhan Donghu Hospital in Hubei Province，Hubei，Wuhan 430074，China

Objective:To explore the effect of Tanshinone Ⅱ A on the peripheral blood CD4+T cells in rats with sepsis.Methods:The sepsis rat model was established by cecal ligation and puncture operation（CLP），and the Tanshinone Ⅱ A（Tan Ⅱ A）was given for consecutive hours.the level of Th1、Th2 and Th17 were assessed by FACS flow cytometer，Enzyme linked immunoadsordent assay（ELISA）was used to determine the levels of serum interleukin-1（IL-1）、interleukin-10（IL-10）、interleukin-17（IL-17）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）were measured before and at 24，48，72 h after the treatment with Tan Ⅱ A.Results:The level of serum TNF-α、IL-17、IL-1 and Th17 ratios in each subgroup of CLP were significantly higher than that of the same period in each subgroup of Sham（P＜0.05）；and serum TNF-α，IL-17，IL-1 levels and Th17 ratio in each subgroup of Tan Ⅱ A were lower than that of the same period in each subgroup of CLP，the difference was statistically significant（P＜0.05）；The serum IL-10 level and the ratio of Th1/Th2 in each subgroup of CLP were lower than that of the same period in each subgroup of Sham（P＜0.05）；and the level of serum IL-10 and the ratio of Th1/Th2 in each subgroup of Tan Ⅱ A were higher than that of the same period in each subgroup of CLP，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion:Tanshinone Ⅱ A shows a protective effect on the immune inflammatory reaction in septic rats may be through the regulation of the peripheral blood CD4+T cells.

Tanshinone Ⅱ A；sepsis；peripheral blood CD4+T cells

R285.5

A

1004-745X（2015）06-0946-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.06.003

2015-02-26）

國(guó)家自然科學(xué)基金（30500657）；湖北省自然科學(xué)基金（2011CDB196）