鄒淑君，張蕾，郭迎喜，于子惠，許樹軍，馬英麗

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

黃酮類化合物有廣泛的藥理活性，被吸收到血液里往往與血清蛋白發(fā)生相互結(jié)合而達(dá)到運(yùn)送和分布的目的［1］。黃酮與蛋白結(jié)合作用的程度、強(qiáng)弱、位點(diǎn)等因素都可能影響它們的吸收、運(yùn)輸、釋放及藥效等。因此，探索黃酮類藥物與蛋白質(zhì)相互識別部位的結(jié)構(gòu)特征及構(gòu)效關(guān)系，有助于深入認(rèn)識黃酮發(fā)揮藥理作用的機(jī)理、藥物代謝及藥效等相關(guān)問題。

橙皮素(Hesperetin)是一種二氫黃酮，在自然界多以連接一個蕓香糖的橙皮苷(Hesperidin)的方式存在。橙皮素和橙皮苷都存在于很多植物中，是中藥材陳皮中的重要有效成分。具有廣泛的生理活性［1］，如雌激素樣活性、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗血小板凝聚、舒張血管、抗動脈粥樣硬化及抗炎等作用［2-4］(結(jié)構(gòu)式見圖1)。本文采用多種光譜法測試二者與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，從作用機(jī)制、作用強(qiáng)弱、作用力類型、結(jié)合距離等測試它們與BSA作用的差異，并分析黃酮類物質(zhì)A環(huán)7位羥基是否糖苷化對與BSA作用的影響。

圖1 橙皮素和橙皮苷的結(jié)構(gòu)式

1 試劑與儀器

RF-5301PC型熒光光度計(日本島津公司);UV-1601PC型紫外可見分光光度計(日本島津公司);PB-20型pH計(德國賽多利斯儀器有限公司)。

橙皮素及橙皮苷(均為98%，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司)，二者分別用少量甲醇溶解后，再用二次蒸餾水定容，配成1×10-4mol/L的溶液;三羥甲基氨基甲烷(Tris，99.8%，上海博宏生物科技有限公司);牛血清白蛋白(BSA，99.8%，美國Sigma公司)，用pH值7.4的Tris-HCl緩沖液(含0.1mol/L NaCl)配成1×10-5mol/L，4℃保存。

2 實(shí)驗方法

2.1 熒光猝滅光譜

分次取0～1000μL的橙皮素或橙皮苷溶液(每次間隔100μL)加入到盛有1.0ml BSA(1.0×10-5mol/L)溶液的10ml容量瓶中，用Tris-HCl(pH=7.40)緩沖液定容。進(jìn)行3次上述操作，分別置于290K、300K、310K水中溫浴15min后測定，固定激發(fā)波長280nm，掃描290～450nm范圍內(nèi)的熒光光譜(激發(fā)狹縫均為5nm，發(fā)射狹縫均為3nm)。

2.2 紫外-可見吸收光譜

室溫下，以pH=7.4的Tris-HCl緩沖液為參比，在200～450nm范圍內(nèi)，分別掃描BSA溶液(1.0×10-6mol/L)、二氫黃酮溶液(1.0×10-6mol/L)和二氫黃酮與BSA(均為1.0×10-6mol/L)混合溶液的紫外光譜。

圖2 橙皮素和橙皮苷對BSA的熒光猝滅光譜

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光猝滅光譜

圖2為300K時，不同濃度的橙皮素或橙皮苷溶液存在下BSA的熒光發(fā)射光譜。由圖2可見，二者都能明顯猝滅BSA的內(nèi)源熒光，且引起B(yǎng)SA的最大熒光發(fā)射波長紅移，橙皮素存在下，紅移2～3nm;橙皮苷存在下，紅移1～2nm。紅移表明氨基酸殘基周圍所處微環(huán)境親水性增加，極性增強(qiáng)［5］。

在290nm～450nm范圍內(nèi)，橙皮素和橙皮苷在實(shí)驗濃度下均無熒光發(fā)射，所以不需考慮“內(nèi)部濾光效應(yīng)”的干擾，則定義熒光猝滅率為η。

F0和F分別是加入化合物前后BSA的熒光強(qiáng)度，在實(shí)驗濃度范圍內(nèi)二者對BSA的熒光猝滅率見圖3?？梢姡瑵舛鹊某绕に貙SA的猝滅程度明顯比橙皮苷大，表明A環(huán)7位羥基糖苷化會降低對BSA的熒光猝滅效率。

圖3 橙皮素和橙皮苷對BSA的熒光猝滅效率

3.2 熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅通常以動態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅為主。動態(tài)猝滅由猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞引起，猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大;靜態(tài)猝滅由猝滅劑與熒光物質(zhì)形成不發(fā)光的配合物引起，猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減小。動態(tài)猝滅過程可根據(jù) Stern-Volmer方程描述［6］。

式中F0和F分別為未加入和加入化合物時BSA的熒光強(qiáng)度，Kq為雙分子碰撞猝滅常數(shù)，它反映體系中分子的彼此擴(kuò)散和相互碰撞對生物大分子熒光壽命衰減速率的影響，且各類猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅常數(shù)為2.0×1010L/(mol·s)。［Q］為猝滅物質(zhì)濃度。Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)，它描述熒光物質(zhì)與猝滅劑分子彼此擴(kuò)散和相互碰撞達(dá)到動態(tài)平衡時的量效關(guān)系。τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的熒光壽命，對于生物大分子［10-11］τ0=10-8s。

若假設(shè)所考察的兩種黃酮對BSA是動態(tài)猝滅，以(F0/F-1)對［Q］進(jìn)行線性擬合，斜率就是Ksv，進(jìn)而求得Kq，相應(yīng)數(shù)據(jù)見表1。由表1可見，橙皮素、橙皮苷對BSA猝滅的Kq均大于2.0×1010L/(mol·s)，橙皮素猝滅BSA的Ksv隨著溫度的升高而減小，而橙皮苷猝滅BSA的Ksv隨著溫度的升高呈現(xiàn)不規(guī)律性變化。因此認(rèn)為橙皮素對BSA的熒光猝滅不是動態(tài)猝滅，而是由于形成了復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅;橙皮苷對BSA的熒光猝滅既包含動態(tài)猝滅，也存在靜態(tài)猝滅。

表1 橙皮素和橙皮苷與BSA作用的Ksv、Kq、Ka及n

圖4 BSA-橙皮素及BSA-橙皮苷體系的紫外可見吸收光譜

3.3 紫外-可見吸收光譜

熒光動態(tài)猝滅影響到熒光體的激發(fā)態(tài)，而不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜，靜態(tài)猝滅往往生成基態(tài)復(fù)合物，會導(dǎo)致熒光物質(zhì)吸收光譜改變［6］。為進(jìn)一步確定橙皮素和橙皮苷對BSA的熒光猝滅機(jī)理，考察了體系的紫外可見吸收光譜，見圖4。

圖4中譜線a是BSA的吸收峰，主要由色氨酸和酪氨酸芳雜環(huán)的π-π*和n-π*躍遷引起;譜線b是橙皮素或橙皮苷的吸收;c線是等濃度橙皮素/橙皮苷與BSA混合體系的吸收譜。由圖4可見，橙皮素與BSA等濃度混合后，導(dǎo)致BSA在278nm處的最大吸收峰略紅移。BSA也使橙皮素在320nm以后的吸收略紅移;橙皮苷與BSA等濃度混合后，基本未導(dǎo)致BSA在278nm處的最大吸收峰發(fā)生移動。BSA使橙皮苷在320nm以后的吸收略紅移，且有輕微增色效應(yīng)。因此，進(jìn)一步認(rèn)為橙皮素對BSA的猝滅機(jī)理以靜態(tài)猝滅為主;橙皮苷對BSA的猝滅機(jī)理以動態(tài)猝滅為主，但同時含有靜態(tài)猝滅。

3.4 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

小分子藥物對蛋白質(zhì)大分子的靜態(tài)猝滅體系中，結(jié)合常數(shù)Ka及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可以用下面的雙對數(shù)方程式來推導(dǎo)［6-7］。

固定BSA的濃度，改變橙皮素或橙皮苷的濃度，以lg［(F0-F)/F］對 lg［Q］作圖可得直線，由直線的斜率及截距可分別求得不同溫度下反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)Ka及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。由表1可知，BSA與橙皮素的結(jié)合常數(shù)Ka數(shù)值為104量級，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)小于1，與橙皮苷的結(jié)合常數(shù)Ka數(shù)值為103～104量級，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)大于1。說明這兩種化合物可以被BSA儲存和運(yùn)輸。并且同溫度下，橙皮素與BSA結(jié)合程度明顯大于橙皮苷與BSA結(jié)合的程度。

3.5 熱力學(xué)參數(shù)和作用力類型

根據(jù)Ross等人的研究結(jié)果的分析方法，大致判斷橙皮素及橙皮苷與BSA之間的作用力類型。在290～310K范圍內(nèi)二者與BSA作用的ΔG、ΔH及ΔS見表2。由表2可見，二者與BSA結(jié)合，均有ΔG＜0，表明它們與BSA的作用過程均為Gibbs自由能降低的自發(fā)過程。橙皮素與BSA的作用過程是ΔH＜0，ΔS＜0，表明氫鍵和范德華力是橙皮素與BSA間的主要作用力。對于橙皮苷與BSA的作用過程有:△H＞0，△S＞0，表明疏水作用力是橙皮苷與BSA的主要作用力［6-8］。

表2 橙皮素及橙皮苷與BSA作用的熱力學(xué)參數(shù)及依據(jù)非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計算的結(jié)合距離

圖5 橙皮素及橙皮苷的紫外吸收與BSA熒光光譜的重疊譜

3.6 作用距離

根據(jù)F?ster能量轉(zhuǎn)移理論，運(yùn)用如下關(guān)系式就可以求出小分子在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)與BSA分子中產(chǎn)生熒光的基團(tuán)之間的距離r［8］。

其中E是能量轉(zhuǎn)移效率;R0為E=50%的臨界距離;F0和F分別為未加入和加入化合物時BSA的熒光強(qiáng)度;K2為偶極空間取向因子，一般取給體與受體各向隨機(jī)分布的平均值2/3;n為介質(zhì)折射常數(shù)，取水和有機(jī)物的平均值1.336;為BSA的熒光量子產(chǎn)率，通常取色氨酸的量子產(chǎn)率0.15;J為給體熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊積分;F(λ)是熒光給體在波長λ處的熒光強(qiáng)度;ε(λ)是受體在波長λ處的摩爾吸光系數(shù).根據(jù)公式(6)求出J，代入公式(5)求出R0，再根據(jù)公式(4)求出r。如果r＜7nm，就認(rèn)為發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移［8］。

圖5為300K，濃度為1.0×10-6mol/L的橙皮素或橙皮苷的紫外吸收光譜與1.0×10-6mol/L的BSA的熒光光譜的重疊圖譜，相關(guān)數(shù)據(jù)計算結(jié)果見表2。

由表2可見，兩種黃酮小分子在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)與蛋白質(zhì)分子中的色氨酸殘基的距離均有r＜7nm，具備了能量轉(zhuǎn)移猝滅蛋白質(zhì)熒光的條件，因此非輻射能量轉(zhuǎn)移也是二者引起B(yǎng)SA熒光猝滅的原因之一。橙皮素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)與色氨酸殘基的距離明顯比橙皮苷與BSA的結(jié)合位點(diǎn)與色氨酸距離小，所以可以說明橙皮素與BSA色氨酸殘基結(jié)合得更緊密。

4 結(jié)論

總結(jié)兩種二氫黃酮對BSA的熒光猝滅率、猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、作用距離等可以說明，黃酮A環(huán)7位羥基糖苷化導(dǎo)致與BSA之間的親和力減弱，作用距離增大，且影響與BSA間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及作用力類型。因此，橙皮素與BSA的結(jié)合能力明顯強(qiáng)于橙皮苷，說明橙皮素比橙皮苷更容易被血清蛋白貯存和運(yùn)輸。也表明黃酮A環(huán)7位羥基是否糖苷化直接影響其與BSA相互作用的強(qiáng)度和結(jié)合力的方式。這在二氫黃酮及苷作為藥物或食品添加劑使用時，從生物利用度、作用機(jī)理和代謝過程等方面考慮有重要的參考意義。

［1］ 張英霞，張云.血清白蛋白的功能及應(yīng)用［J］.海南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007，25(3):315-320.

［2］ 劉學(xué)仁，張瑩.橙皮苷和橙皮素生物活性的研究進(jìn)展［J］.中國新藥雜志，2011，20(4):329-333.

［3］ 鄒淑君，于子惠，許樹軍，等.橙皮苷及橙皮素清除自由基活性的研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2013，41(1):65-67.

［4］ 魏曉芳，丁西明，劉會洲.pH誘導(dǎo)牛血清白蛋白芳香氨基酸殘基微環(huán)境變化的光譜分析［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2000，20(4):556-559.

［5］ 李悅，谷雨，何佳，等.光譜法與分子模擬技術(shù)研究楊梅素與牛血清白蛋白的相互作用［J］.化學(xué)學(xué)報，2012，70(2):143-150.

［6］ 董念，曹淑紅，陳曉青，等.不同取代羥基黃酮類化合物與血清白蛋白的相互作用分析［J］.分析測試學(xué)報，2009，28(1):49-54.

［7］ Ross PD，Subramanian S.Thermodynamics of protein association reactions:forces contributing to stability［J］.Biochemistry，1981，20(11):3096-3102.

［8］ 武旭芳，段志芳，李充璧.7-肉桂酰橙皮素銅配合物的固相合成及清除自由基作用研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2013，41(4):19-22.