楊平榮 楊英 石勇

(1.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所,甘肅蘭州 730101)

幾種婦科中藥栓劑和洗液的體外抑菌對比研究

楊平榮1楊英2石勇2

(1.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所,甘肅蘭州 730101)

目的：觀察中藥栓劑和洗劑的體外抑菌活性。方法：用瓊脂擴(kuò)散法和微量稀釋法研究中藥栓劑和洗劑體外抑菌活性,以抑菌圈和最小抑菌濃度(MIC)為評價(jià)指標(biāo)。結(jié)果：中藥栓劑和洗劑具有抑制金黃色葡萄球菌、耐藥表皮葡萄球菌、非耐藥金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單孢桿菌、白色念珠菌的生長繁殖的活性。不同制劑以及不同濃度抑菌活性有差異。結(jié)論：苦參霉菌栓和復(fù)方黃松洗液具有較強(qiáng)的抗菌活性。尤其對臨床分離菌株白色念珠球菌和耐藥表皮葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用,具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

中藥栓劑和洗劑 抑菌活性 最小抑菌濃度

陰道炎是最為常見的婦科疾病之一，常常困擾著廣大婦女。近年來，由于社會(huì)競爭的加劇，生活節(jié)奏的改變，導(dǎo)致一些婦女的免疫力下降，陰道炎的發(fā)病率逐年增加，而且它可引起多種婦產(chǎn)科疾病，如盆腔炎，以及早產(chǎn)、產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎等。

陰道炎因致病菌的不同主要分為細(xì)菌性、霉菌性、滴蟲性陰道炎。引起婦科疾病的致病菌有大腸桿菌、淋球菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌和白色念珠菌等真菌[1]。白色念珠菌屬重要的條件致病菌，白色念珠菌引起的陰道炎發(fā)病率逐年升高，目前臨床上用于治療細(xì)菌，霉菌等引起陰道炎的中藥制劑品種較多的，如何選用一種理想的藥物，提高療效.是臨床用藥的一個(gè)問題.而且隨著國家對藥品實(shí)行處方藥和非處方藥的分類管理，鼓勵(lì)消費(fèi)者在藥店自信判斷，購買和使用非處方藥，隨著醫(yī)藥超市的發(fā)展，很多人選擇自己購藥治病，為此，筆者選擇了目前常用的兩種栓劑和兩種洗劑進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，旨在為臨床合理用藥，指導(dǎo)合理購藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 供試藥品

蒙伊苦參霉菌栓(內(nèi)蒙古天成有限責(zé)任公司，批號：20060206)；

治糜靈栓(通化金馬藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號：20060109)；

復(fù)方黃松洗液(廣西源安堂藥業(yè)有限公司，批號：200604723)；

紅核婦潔洗液(生產(chǎn)企業(yè)：深圳帝陽藥業(yè)有限公司，批號：20060601)。

1.2 試驗(yàn)菌種

標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923、大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 25922、銅綠假單孢桿菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC2785、臨床分離菌：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、耐藥表皮葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis)、白色念珠菌(Candida albicans)、非耐藥金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus)、糞腸球菌(Enterococccus faecalis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)。以上菌株由甘肅省臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

MH瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(購于中國藥品生物制品鑒定所)DMSO(細(xì)胞級別Sigma分裝)。

2 方法

2.1 供試藥品制備

苦參霉菌栓，治糜栓用DMSO溶解，配制成濃度為0.1g/ml。

紅核婦潔洗液和復(fù)方黃松洗液測試濃度為原液及10倍稀釋液，10倍稀釋液也為藥物的臨床使用濃度。

表2. 藥物最小抑菌濃度(MIC)結(jié)果(單位:mg/ml)Table2. Minimum inhibitory concentrations of Ershiwuwei Songshi Pills (mg/ ml)

2.2 菌液制備

平板劃線活化菌種，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，挑取單菌落，接種于1ml生理鹽水中作為初始菌懸液，吹打均勻；

菌懸液a：吸取初始菌懸液50μl于950μl生理鹽水中混勻，調(diào)節(jié)菌液濃度為106CFU/ml，用于抑菌圈測定；

菌懸液b：吸取初始菌懸液500μl于10ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)菌液濃度為106CFU/ml，用于最小抑菌濃度(MIC)的測定。

2.3 抑菌圈測定

制備MH瓊脂培養(yǎng)基平板和PDA培養(yǎng)基平板，用無菌移液吸取菌懸液a200μl滴加于MH瓊脂培養(yǎng)基平板和PDA培養(yǎng)基平板(用于白色念珠球菌)表面，涂布均勻，放置牛津杯，待菌液浸入且牛津杯吸附后加藥樣于牛津杯中，供試藥物的體積以及濃度分別為：苦參霉菌栓和治糜栓加樣量為100μl，200μl，濃度0.1g/ml配制液， 紅核婦潔洗液和復(fù)方黃松洗液加100μl的原液及10倍稀釋液，同時(shí)設(shè)立對照，以左氧氟沙星為細(xì)菌陽性對照， 氟康唑?yàn)榘咨钪榍蚓年栃詫φ?，溶劑為陰性對照，?7℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h(白色念珠球菌30℃培養(yǎng)48h)，測定抑菌直徑DD。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，每次三個(gè)平行，數(shù)據(jù)取平均值。

2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定

采用微量稀釋法[2-3]，方法加以改進(jìn)。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加100μl牛肉膏液體培養(yǎng)基，分別加入100μl用100mg/ml的苦參霉菌栓和治糜栓配制液，采用二倍稀釋法，稀釋得到藥液濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.195、0.098、0.049mg/ml。紅核婦潔洗液和復(fù)方黃松洗液加入100μl原液對比稀釋，得一系列體積百分濃度。同時(shí)設(shè)培養(yǎng)基對照孔、菌液對照孔以及培養(yǎng)基與藥液對照孔，微孔板加蓋并用封口膠密封以減少孵育過程中水分的蒸發(fā)，將微孔板放在鋪有濕紗布的方形搪瓷盤中，細(xì)菌于37℃溫箱中孵育24h，白色念珠球菌于28℃溫箱中孵育48h，眼觀無細(xì)菌生長孔所含最低藥物濃度即為最小抑菌濃度。

3 結(jié)果

3.1 供試藥物抑菌圈結(jié)果

實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌、耐藥表皮葡萄球菌、非耐藥金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌代表革蘭氏陽性菌，以大腸埃希菌、銅綠假單孢桿菌代表革蘭氏陰性菌，白色念珠菌代表酵母樣真菌對這四種婦科栓劑和洗劑進(jìn)行體外抑菌活性的初步研究，其抑菌結(jié)果見表1。結(jié)果表明：苦參栓抑菌作用很強(qiáng)，顯著抑制金黃色葡萄球菌、耐藥表皮葡萄球菌、非耐藥金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單孢桿菌、白色念珠菌的生長繁殖，形成抑菌圈直徑范圍為10～24cm；兩種濃度無顯著差異。比較藥品對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的作用活性，已無顯著差異，苦參栓僅對綠膿桿菌作用較弱。治糜栓能夠抑制試驗(yàn)菌得生長繁殖活性，但作用相對較弱，形成抑菌圈直徑范圍為8～18cm。對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌已沒有顯著差異，兩種濃度下，抑菌活性差異較大，濃度越大，抑菌圈直徑越大，其抑菌活性和濃度呈正相關(guān)。紅核婦潔洗液在原液濃度下抑菌作用較強(qiáng)，抑菌圈直徑為18cm左右，尤其對白色念珠菌作用強(qiáng)大，抑制圈達(dá)28cm，而10倍稀釋后，沒出現(xiàn)抑制圈。復(fù)方黃松洗液在原液和10倍稀釋濃度下均有抑制圈，形成抑菌圈直徑范圍為12～18cm，同樣對對白色念珠菌作用強(qiáng)大，抑制圈達(dá)29cm。兩種洗液對于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌已沒有顯著差異。

陽性對照：左氧氟沙星濃度為0.04mg/ml，氟康唑濃度為0.2mg/ml，陰性對照分別為DMSO，及無菌水。

3.2 供試藥物最小抑菌濃度(MIC)結(jié)果

采用微量稀釋法測定不同供試藥物的最小抑菌濃度，結(jié)果如表2所示：苦參霉菌栓、治糜靈栓、紅核婦潔洗液和復(fù)方黃松洗液其MIC范圍分別為：0.049-50mg/ml，25-50mg/ml，0.195%-5%，0.012%-0.39%。此結(jié)果與抑菌圈測定結(jié)果一致。苦參霉菌栓MIC值很小，其抑菌活性很強(qiáng)。復(fù)方黃松洗液比紅核婦潔洗液的MIC值低，其抑菌活性強(qiáng)于紅核婦潔洗液。4種供試藥物對銅綠假單孢桿菌作用較弱。

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表明供試藥物對革蘭氏陽性菌如：金黃色葡萄球菌、耐藥表皮葡萄球菌、非耐藥表皮葡萄球菌、枯草桿菌、臘狀芽孢桿菌、以及糞腸球菌。革蘭氏陰性菌如：銅綠假擔(dān)胞桿菌、大腸桿菌都的抑制作用?？梢妺D科常用栓劑和洗劑抗菌作用廣譜，對各種易引起婦科感染的致病菌均有一定的抑制作用。

結(jié)果顯示：在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，供試藥物對標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株的抑菌作用都有差異，對所有菌株的抑菌作用強(qiáng)弱為：苦參霉菌栓＞治糜栓， 復(fù)方黃松洗液＞紅核婦潔洗液(除大腸桿菌外)?？鄥⒚咕ㄖ饕锌鄥ⅰⅫS柏、五倍子等藥材提純物組成，其抗菌作用強(qiáng)大，與提取物中活性成分密切相關(guān)。這也說明中藥復(fù)方制劑要發(fā)揮較強(qiáng)的藥理活性，不再是單純的粗提物，而應(yīng)運(yùn)用現(xiàn)代藥學(xué)理論，提高技術(shù)工藝，提取精制，提高其藥效。治糜靈栓由黃柏、苦參、兒茶、冰片、枯礬等藥物組成，其直接抑菌作用并不強(qiáng)，推測其發(fā)揮藥效作用也許是通過其他中醫(yī)理論作用，而不是直接抗菌。紅核婦潔洗液(山楂核蒸餾液)和黃松洗液(主要成分由地膚子、千里光、黃柏、崗松油、大葉桉油、滿山香油、蛇床子油組成)在原液濃度下均具有較強(qiáng)的抑菌作用，但在臨床使用濃度下，即10倍稀釋，山楂洗液沒有顯示抑菌活性。黃松洗液稀釋液仍具有抑菌活性，其抑菌作用為各組成成分發(fā)揮作用[4]。因?yàn)橄匆菏峭庥脹_劑，應(yīng)用原液刺激性大，不適合于臨床，但稀釋后抑菌活性降低，因此，尋找既能降低刺激性又能保持作用較強(qiáng)的婦科外用洗劑，也是產(chǎn)品研發(fā)中需注意的問題和克服的難題。

兩種栓劑雖然均由黃柏、苦參為主要成分，黃柏、苦參的抑菌作用已被報(bào)道和證實(shí)[5-6]，苦參霉菌栓為提純物，治糜栓為粗提物， 結(jié)果顯示二者差異很大，外用洗液結(jié)果表明中藥復(fù)方制劑的作用大于單味組成制劑，其機(jī)理因?yàn)楦鹘M成成分具有協(xié)同作用。

供試藥物具有抗菌譜廣，尤其對白色念珠菌抑制效果很強(qiáng)，臨床感染中，白色念珠菌為婦科感染的嚴(yán)重病原菌，80%的霉菌性陰道炎致病菌為白色念珠菌。近幾年來，由于抗生素和免疫抑制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，白念珠菌感染呈上升趨勢，并以躍居深部真菌感染的第一位。本次實(shí)驗(yàn)顯示苦參栓對白色念珠球有顯著的抑制作用作用，最小抑菌濃度達(dá)0.049mg/ml，從對臨床分離淋的白色念珠球菌抑制作用可見，該制劑對因白色念珠球菌引起的疾病有顯著療效。兩種洗液亦具有較強(qiáng)的抑制白色念珠球菌的作用。而且苦參栓對耐藥表皮葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)達(dá)到0.049mg/ml，這為解決長期以來困擾人類的細(xì)菌耐藥性問題提供了初步的研究基礎(chǔ)，為這種藥在臨床上的長期使用提供了依據(jù)。因此我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床治療婦科感染提供了依據(jù)。我們的結(jié)果表明苦參霉菌栓和復(fù)方黃松洗液為良好的婦科臨床用藥。

[1]聞?dòng)衩?現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微生物.上海.上海醫(yī)科大學(xué)出版社,2001：677.

[2]Karaman, S., Digrak, M., Ravid, U., et al., Antibacterial and antifungal activity of the essential oils of Thymus revolutus celak from Turkey. Journal of Ethnopharmacology 2001,.76：183：186.

[3]Yu,J.Q.,Lei,J.H., Yu, H.D.,Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Scutellaria barbata.Phytochemistry,65,881-884.2004.

[4]吳斌,林文輝,高慧媛.麻葉千里光抗菌化學(xué)成分的研究(Ⅱ).《中草藥》,2005,36：10.

[5]劉文雅,劉漢清.苦參堿的藥理研究進(jìn)展.《中華實(shí)用中西醫(yī)雜志》,2006,19：4.

[6]陳蕾,邸大琳.黃柏體外抑菌作用研究.《時(shí)珍國醫(yī)國藥》,2006,17：5.