蔡 梟，安 洪，胡庭義， 陳 瀟， 范 偉

(重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 骨科, 重慶 400016)

研究論文

不同載荷運(yùn)動(dòng)對(duì)去勢(shì)雌性大鼠骨關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)及代謝的影響

蔡 梟，安 洪，胡庭義， 陳 瀟， 范 偉*

(重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 骨科, 重慶 400016)

目的研究不同載荷情況下運(yùn)動(dòng)對(duì)去勢(shì)大鼠骨關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)和代謝方面的影響。方法SD大鼠在成功制備為骨質(zhì)疏松模型后，隨機(jī)分為安靜組、低載荷運(yùn)動(dòng)組、中載荷運(yùn)動(dòng)組和高載荷運(yùn)動(dòng)組，各10只進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)；運(yùn)動(dòng)3個(gè)月后處死大鼠，收取膝關(guān)節(jié)標(biāo)本及血液，進(jìn)行大鼠血清相關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)，進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)(HE染色、番紅O染色、甲苯胺染色)檢查及免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白含量。結(jié)果形態(tài)學(xué)及血清檢測(cè)結(jié)果表明，中載荷運(yùn)動(dòng)組有利于維持關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)(Plt;0.05)；而與安靜組、低載荷和中載荷運(yùn)動(dòng)組相比較，高載荷運(yùn)動(dòng)組則不利于關(guān)節(jié)軟骨的生長(zhǎng)，使關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)退變樣改變(Plt;0.05)。結(jié)論不同載荷運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的影響不同，適度載荷運(yùn)動(dòng)對(duì)預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松有較好的臨床指導(dǎo)意義。

骨質(zhì)疏松; 骨關(guān)節(jié)軟骨; MMP-3；Ⅱ型膠原蛋白

骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞、骨強(qiáng)度減低而易發(fā)生骨折的一種全身性疾病，以絕經(jīng)后的婦女多發(fā)[1]。研究已經(jīng)表明運(yùn)動(dòng)可以改善絕經(jīng)期患者骨量、骨密度和強(qiáng)度，并且能夠有效預(yù)防骨質(zhì)疏松[2- 4]。

適度運(yùn)動(dòng)是維持正常關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理功能的必要條件，過度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變[5- 6]。當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生變化時(shí)，軟骨基質(zhì)中膠原等成分表達(dá)和分泌均發(fā)生變化[7]。

近些年來，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的研究越來越受到關(guān)注，運(yùn)動(dòng)是提高骨密度和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的重要手段之一。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)處于骨質(zhì)疏松的大鼠給予不同強(qiáng)度的載荷運(yùn)動(dòng)干預(yù)，觀察對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝指標(biāo)及骨組織形態(tài)的影響，以期為運(yùn)動(dòng)手段預(yù)防骨質(zhì)疏松提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雌性SD大鼠40只[體質(zhì)量 290～340 g，重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心，SYXK(渝)2012- 0001]，8周齡，平衡膳食1周，5%水合氯醛 (7 mL/kg)經(jīng)腹腔給麻醉，切除雙側(cè)卵巢。3個(gè)月后經(jīng)雙能X線檢測(cè)骨密度，證實(shí)骨質(zhì)疏松模型制備成功。隨機(jī)分為：去勢(shì)安靜組(OVX,n=10)、去勢(shì)低載荷運(yùn)動(dòng)組(low-loading OVX-RUN，L，n=10)、去勢(shì)中載荷運(yùn)動(dòng)組(medium-loading OVX-RUN，M,n=10)、去勢(shì)高載荷運(yùn)動(dòng)組(high-loading OVX-RUN,H,n=10)分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：免疫組化SP試劑盒(北京中杉金橋生物工程有限公司)；鈣、磷試劑盒、 II 型膠原鼠抗兔多克隆抗體和 MMP-3 Elisa 試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 運(yùn)動(dòng)方案： 在正式實(shí)驗(yàn)開始前1周每天在跑步機(jī)中以慢速(10～15 m/min)跑步30 min，以適應(yīng)跑道。正式實(shí)驗(yàn)后，運(yùn)動(dòng)方案參照文獻(xiàn)[8- 9]運(yùn)動(dòng)處方稍做改進(jìn),建立不同的運(yùn)動(dòng)載荷模型，最大負(fù)重(218±10)g，每次運(yùn)動(dòng)1 h，6 d/周，共計(jì)12周(表1)。

1.2.2 軟骨厚度測(cè)量： 使用帶刻度萊卡顯微鏡進(jìn)行手工測(cè)量，每張切片從最厚到最薄平均取6個(gè)不同的厚度進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量從軟骨表面到鈣化層的厚度，結(jié)果用μm表示。

表1 不同運(yùn)動(dòng)載荷模型Table 1 Different loading exercise model

1.2.3 血清ELISA檢測(cè)MMP-3水平:運(yùn)動(dòng)12周后，以水合氯醛注射腹腔麻醉，打開胸腔，從心尖部進(jìn)針抽血5 mL，低溫2 000 r/min離心15 min，收集上清液，置-80 ℃保存。ELISA法測(cè)定血清MMP-3濃度。

1.2.4 番紅-O染色: 石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，于0.1%番紅-O染液染色。在光鏡下(×400)下由兩位獨(dú)立觀察者按Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，取兩者均值作為最終得分。

1.2.5 甲苯胺藍(lán)染色:石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后。在光鏡下(×400)觀察骨與軟骨細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.6 Ⅱ型膠原蛋白含量測(cè)定:按Ⅱ型膠原蛋白試劑盒所示方法測(cè)定，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件，高倍鏡(×400)下選定單位面積，測(cè)定單位面積Ⅱ型膠原蛋白平均吸光度值。

1.2.7 血清中離子測(cè)定:血清鈣(Ca)測(cè)試方法采用的是甲基百里香酚藍(lán)比色法，通過比色與同樣處理的鈣標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，可計(jì)算出鈣的含量。血清磷(P)測(cè)試方法采用的是孔雀綠直接顯色法，在一定范圍內(nèi)，顏色深度與含量成正比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)結(jié)果

2.1.1 HE染色：安靜組軟骨表面平滑，軟骨細(xì)胞呈圓形或是橢圓形位于軟骨陷窩內(nèi)，排列較規(guī)則(圖1A)；低載荷運(yùn)動(dòng)組軟骨細(xì)胞增多，細(xì)胞排列規(guī)則(圖1B)；中載荷運(yùn)動(dòng)組較低載荷運(yùn)動(dòng)組軟骨細(xì)胞明顯增多，排列規(guī)則(圖1C)；高載荷運(yùn)動(dòng)組軟骨表面不規(guī)則，軟骨細(xì)胞減少明顯，鈣化層可見大量肥大的軟骨細(xì)胞，并且伴有血管翳形成(圖1D)。

2.1.2 番紅O染色：安靜組軟骨表面光滑，軟骨細(xì)胞呈圓形或者橢圓形，基質(zhì)番紅O染色均勻，染色較淡呈紫色(圖2A)；低載荷運(yùn)動(dòng)組細(xì)胞增多，染色深(圖2B);中載荷運(yùn)動(dòng)組細(xì)胞數(shù)目及染色較前兩組增加，可見清晰的潮線(圖2C)；高載荷運(yùn)動(dòng)組可見軟骨表面欠規(guī)則，移形層及放射層細(xì)胞數(shù)減少，潮線不規(guī)則，鈣化層出現(xiàn)肥大細(xì)胞(圖2D)。

2.1.3 甲苯胺藍(lán)染色：安靜組軟骨細(xì)胞排列欠規(guī)則(圖3A)；低載荷運(yùn)動(dòng)組細(xì)胞數(shù)目明顯增多，排列規(guī)則，可見潮線(圖3B);中載荷運(yùn)動(dòng)組細(xì)胞數(shù)目明顯增多，排列規(guī)則，潮線規(guī)則(圖3C)；高載荷運(yùn)動(dòng)組染色較淺，軟骨細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞排列也欠規(guī)則，潮線消失(圖3D)。

2.2免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白及Ⅱ型膠原蛋白平均吸光度值

安靜組軟骨基質(zhì)染色呈棕黃色，主要分布于軟骨表層及放射層(圖4A)；低載荷運(yùn)動(dòng)組基質(zhì)染色較深，主要分布于表層及放射層(圖4B)；中載荷運(yùn)動(dòng)組較其他組明顯加深，細(xì)胞數(shù)目較多(圖4C)；高載荷運(yùn)動(dòng)組可見染色較其他組減少，細(xì)胞數(shù)目減少(圖4D)。與OVX組比較，M組Ⅱ型膠原蛋白平均吸光度值明顯升高(Plt;0.01)，H組吸光度值則明顯降低(Plt;0.01)(表2)。

圖1 各組關(guān)節(jié)軟骨HE染色情況的差異Fig 1 Differences among groups of articular cartilage HE dyeing(×400)

圖2 各組關(guān)節(jié)軟骨番紅O染色差異Fig 2 Differences among groups of articular cartilage sarranine O dyeing(×400)

圖3 各組關(guān)節(jié)軟骨甲苯胺藍(lán)染色情況的差異Fig 3 Differences among groups of articular cartilage Toluidine blue dyeing(×400)

groupaverageopticaldensityoftypeⅡcollagenOVX 0.03±0.00L 0.03±0.01M 0.04±0.01*#H 0.02±0.00*#

*Plt;0.01 compared with OVX；#Plt;0.05 compared with L.

2.3 各組大鼠血清鈣、磷濃度

與OVX組相比，L、M組鈣、磷含量明顯降低，H組含量明顯增高(Plt;0.05)。與L組相比，M組鈣、磷含量也明顯較低(Plt;0.05)(表3)。

表3 血清鈣、磷濃度

*Plt;0.01，**Plt;0.05 compared with OVX；#Plt;0.01；##Plt;0.05 compared with L.

2.4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨厚度、Mankin評(píng)分

L、M組關(guān)節(jié)軟骨厚度較OVX組明顯增厚(Plt;0.01),H組的軟骨厚度則明顯減少。M組的Mankin評(píng)分與L組比較明顯較低，H組的Mankin評(píng)分則明顯升高(Plt;0.01)(表4)。

2.5 血清中MMP-3濃度

與OVX組相比較,L、M組MMP-3含量明顯較低(Plt;0.05)；與L組相比較，M組MMP-3的含量未見明顯變化,而H組的MMP-3的含量則明顯增高(Plt;0.01)(表5)。

表4 關(guān)節(jié)軟骨厚度、Mankin評(píng)分

*Plt;0.01，**Plt;0.05 compared with OVX；#Plt;0.01；##Plt;0.05 compared with L.

表5 血清中MMP-3濃度Table 5 Expression of MMP-3 in blood (±s，n=10)

*Plt;0.01,**Plt;0.05 compared with OVX；#Plt;0.01，##Plt;0.05 compared with L.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過采用均為正常年齡的雌性大鼠模擬骨質(zhì)疏松的模型來研究不同載荷運(yùn)動(dòng)對(duì)骨關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)及代謝的影響，而老年的大鼠由于存在雌激素水平的降低導(dǎo)致骨量的丟失，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

本實(shí)驗(yàn)低載荷及中載荷運(yùn)動(dòng)可以降低大鼠血清中的鈣、磷、MMP-3的含量，尤其以中載荷更為明顯，證明適宜載荷運(yùn)動(dòng)可以降低血鈣、磷及MMP-3的含量,對(duì)骨代謝產(chǎn)生了有益的作用，促進(jìn)了骨骼的礦化。這與目前多數(shù)研究結(jié)果“大鼠運(yùn)動(dòng)后血清中鈣及MMP-3的濃度明顯減少”。同時(shí)低、中載荷可以增加關(guān)節(jié)軟骨的厚度，Mankin評(píng)分則較低。而高載荷運(yùn)動(dòng)的軟骨厚度明顯降低，Mankin評(píng)分則明顯較高。結(jié)果均表明高載荷運(yùn)動(dòng)組對(duì)關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生負(fù)面的效應(yīng)，而中載荷運(yùn)動(dòng)組有利于維持骨關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)。

細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分包括Ⅱ型膠原和蛋白聚糖聚集物,二者的轉(zhuǎn)換和降解失衡時(shí)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生降解，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的破壞[10- 11]。Ⅱ型膠原免疫組化結(jié)果提示,低、中載荷運(yùn)動(dòng)組對(duì)維持關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)是有利的,而高載荷運(yùn)動(dòng)組對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)產(chǎn)生負(fù)作用，出現(xiàn)了關(guān)節(jié)軟骨的破壞。

基于上述研究結(jié)果，低載荷和中載荷運(yùn)動(dòng)為利于大鼠關(guān)節(jié)軟骨生存的“安全窗口”。運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體的影響是雙向的，最終結(jié)果取決于負(fù)荷大小。適度的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用，而且在一定運(yùn)動(dòng)負(fù)荷內(nèi)，運(yùn)動(dòng)的強(qiáng)度越大則表現(xiàn)出更好的效果，過度的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷可使骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率更高，而中等以下強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)有益于軟骨的健康。本研究結(jié)果證實(shí)不同的力學(xué)負(fù)荷對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的影響不一，適宜的力學(xué)負(fù)荷在改善骨質(zhì)疏松狀況的情況下，有利于骨關(guān)節(jié)軟骨的健康，而過度的力學(xué)負(fù)荷不僅不利于骨質(zhì)疏松的改善，而且還導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞。

[1] Sakakura Y, Shide N, Tsuruga E,etal.Effects of running exercise on the mandible and tibia of ovariectomized rats[J].J Bone Miner Metab, 2001,19:159- 167.

[2] Going S, Lohman T, Houtkooper L,etal.Effects of exercise on bone mineral density in calcium-replete postmenopausal women with and without hormone replacement therapy[J]. Osteoporosis Int, 2003,14:637- 643.

[3] Joo YI, Sone T, Fukunaga M,etal.Effects of endurance exercise on three-dimensional trabecular bone microarchitecture in young growing rats[J].Bone,2003,33:485- 493.

[4] Tromp AM, Bravenboer N, Tanck E,etal.Additional weight bearing during exercise and estrogen in the rat: the effect on bone mass, turnover, and structure[J]. Calcif Tissue Int, 2006,79:404- 415.

[5] Hagiwara Y,Ando A,Chimoto E,etal. Changes of articular cartilage after immobilization in a rat knee contracture model[J]. J Orthop Res,2009,27:236- 242.

[6] Chang Q,Huang C,Huang Z. Matrix Metalloproteinases and inhibitor in knee synovial fluid as cartilage biomarkers in rabbits:the effect of high-intensity jumping exercise[J].J Surg Res,2007,140:149- 157.

[7] Hagiwara Y,Ando A,Chimoto E,etal. Expression of collagen typesⅠ and Ⅱ on articular cartilage in a rat knee contracture model[J].Connect Tissue Res,2010,51:22- 30.

[8] Bedford TG,Tipton CM,Wilson NC,etal.Maximm oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J].J Appl Physiol,1979,47:1278- 1283.

[9] 閆萬軍．負(fù)重跑訓(xùn)練對(duì)老齡大鼠肌肉丟失的影響[J]. 中國(guó)體育科技.2009,45:46- 47.

[10] Trudel G, Uhthoff H, Laneuville O. Knee joint immobility induces Mcl-1 gene expression in articular chondrocytes[J].Biochem Bioph Res Co, 2005, 333:247- 252.

[11] Mio K, Saito S, Tomatsu T,etal. Intermittent compressive strain may reduce aggrecanase expression in cartilage: a study of chondrocytes in agarose gel[J].Clin Orthop Relat Res, 2005, 433:225- 232.

Effect of different loading exercise on morphology and metabolism of articular cartilage in ovariectomized female rats

CAI Xiao, AN Hong, HU Ting-yi, CHEN Xiao, FAN Wei*

(Dept. of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

ObjectiveTo investigate the influence of loading exercise on morphology and metabolism of articular cartilage in ovariectomized rats.MethodsForty female Sprague-Dawley rats were randomly assigned into 4 groups: ovariectomized (OVX), ovariectomized plus low loading exercise (low loading OVX-RUN), ovariectomized plus medium loading exercise (medium OVX-RUN), ovariectomized plus high loading exercise (high loading OVX-RUN); After 12 weeks, the following variables were compared among the 4groups. Knee joint and blood samples were collected; Test of rat serum related material were carried on the articular cartilage morphology (HE dyeing, sarranine O dyeing, toluidine) examination and immunohistochemical staining to detect the content of type Ⅱ collagen in articular cartilage.ResultsMedium OVX-RUN group was helpful to maintain the steady state of articular cartilage (Plt;0.05). Compared with OVX,low loading OVX-RUN group and medium OVX-RUN group, high loading OVX-RUN group was not conducive to the growth of the articular cartilage,induce the degenerative-like changes in articular cartilage(Plt;0.05).ConclusionsThe different loading exercise has different effect on the cartilage of rats, moderate loading exercise on the prevention and treatment of osteoporosis has useful clinical significance.

osteoporosis; articular cartilage；matrix metalloproteinase-3；type Ⅱ collagen

2014- 01- 16

2014- 04- 12

*通信作者(correspondingauthor)：fanweicqmu@163.com

1001-6325(2014)06-0792-05

R 322.7+1

A