馮悅華 羅光華△ 陳立新

高胰島素-正血糖鉗夾技術（HEC）是評價胰島素敏感性的金標準[1-2]。國內關于此技術應用于實驗動物（大鼠）的報道目前為止大多可分兩類，一類是在術后麻醉狀態(tài)下進行，或者是術后第2天清醒狀態(tài)下進行，但麻醉或術后造成的胰島素抵抗影響極大[3]；另一類研究的比較多，是給大鼠尾動靜脈插管而行替代實驗，避免大范圍損傷但需長期維持局部麻醉，目前未被國際廣泛認可。本研究根據國外文獻報道結合實際操作方法建立了大鼠清醒狀態(tài)下的HEC技術，并且通過給正常大鼠短期輸注脂肪乳，初步建立脂毒性胰島素抵抗模型，從而為研究脂毒性胰島素抵抗提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物準備 選用250～300 g的SPF級雄性SD大鼠10只，購置并飼養(yǎng)在中國科學院上海實驗動物中心，條件：12 h明暗交替，室溫22～25℃，濕度40%～70%。動物購入后適應性喂養(yǎng)1周，期間飼以基礎飼料，自由攝食飲水。

在正式開始鉗夾實驗7 d前，10%水合氯醛麻醉大鼠，行左頸動脈-右頸靜脈插管術。在無菌狀態(tài)下切開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露右側頸靜脈和左側頸動脈。硅膠管2根（內徑0.5 mm），經50 IU/mL肝素化處理，分別植入頸動、靜脈。靜脈導管置于右心房水平，動脈導管置于主動脈弓水平，2根導管均經皮下隧道延至頸背部引出，見圖1。導管用生理鹽水（含50 IU/mL的肝素）沖洗，最后用500 IU肝素和300 g/L的PVP-10聚乙烯吡咯烷黏稠溶液封管。術后單籠飼養(yǎng)。大鼠術后恢復1周，待體質量恢復、活動如初時進行清醒狀態(tài)下脂肪乳輸注和HEC實驗，見圖2。

Figure 1 Rats with catheterizing in the right jugular vein and left carotid artery圖1 大鼠左頸動脈及右頸靜脈置管圖

Figure 2 The experimental figure of fat emulsion infusion and hyperinsulinemic-euglycemic clamp in rats圖2 大鼠脂肪乳輸注和高胰島素-正常血糖鉗夾實驗圖

1.2 大鼠脂肪乳輸注合并HEC實驗 大鼠隔夜禁食12 h，以隨機數字表法分為2組，每組5只。對照組頸內輸注5%葡萄糖加肝素鈉（葡萄糖購于華裕制藥有限公司，肝素鈉購于常州千紅生化制藥股份有限公司），脂肪乳組頸內輸注20%脂肪乳加肝素鈉（20%脂肪乳購于華瑞制藥有限公司）。

2組大鼠分別從頸動脈抽取血液，羅氏羅康全活力血糖儀測定基礎血糖（BBG）。然后分別通過頸靜脈持續(xù)輸注20%脂肪乳加肝素和5%葡萄糖加肝素6 h，20%脂肪乳或5%葡萄糖輸注率為10 mL·kg-1·h-1，合并肝素（速率為0.097 5 IU/min），并在最后90 min引入HEC實驗。HEC實驗開始后，在輸注原液體的同時恒定輸注胰島素10 mU·kg-1·min-1，之后每5 min測定血糖1次。當血糖值低于5.0 mmol/L時開始輸注20%葡萄糖（購于Amresco公司），調整葡萄糖輸注速率使血糖控制在5.0～6.0 mmol/L左右。取穩(wěn)定狀態(tài)及以后的血糖值的均數為穩(wěn)定血糖濃度（SBG）。記錄穩(wěn)態(tài)下連續(xù)3～5次葡萄糖輸注速率，其均值即為此大鼠的葡萄糖輸注率（Glucose infusion rate，GIR）[1]。實驗結束后將大鼠處死，取肝組織凍于液氮中備用。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件對數據進行處理，實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，2組間的比較采用t檢驗，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組穩(wěn)定血糖濃度比較 2組間BBG和SBG波動在6.30 mmol/L和5.55 mmol/L左右，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），見表1。

Table 1 Comparison of basal glucose and SBG data between two groups表1 2組初始血糖和穩(wěn)定血糖濃度比較 （mmol/L，x±s）

2.2 脂肪乳輸注對血漿FFA、GIR影響 大鼠輸注20%脂肪乳6 h后，血漿FFA水平升高到對照組（輸注5%葡萄糖）的17.6倍（t=11.20,Plt;0.01），見圖3，GIR下降了27%（t=3.987,Plt;0.01），見圖4。

Figure 3 Effects of intralipid-infusin on plasma FFA in rats圖3 脂肪乳輸注對大鼠血漿FFA的影響

Figure 4 Effects of intralipid-infusin on GIR in rats圖4 脂肪乳輸注對大鼠GIR的影響

3 討論

自1983年Kraegen等[4]建立大鼠高胰島素-正血糖鉗夾技術以來，國外已經廣泛使用，成為研究胰島素抵抗的基本技術之一。但在國內未能普遍使用，原因主要是傳統(tǒng)的HEC技術需要在大鼠體內留置導管1周以避免術后應激，雖然結果準確可靠，但是術后感染、大鼠咬斷導管，尤其是導管堵塞等問題常導致整個實驗失敗。也有人用麻醉狀態(tài)下頸動靜脈或者股動靜脈插管術進行鉗夾實驗，但麻醉狀態(tài)下血糖濃度顯著升高，大腦及骨骼肌糖利用減少，胰島素拮抗激素分泌增加，本身存在胰島素抵抗[5]，不能真實反映大鼠體內實際情況，所以必須保證大鼠在清醒狀態(tài)下施行HEC技術。針對上述問題，本研究嘗試將傳統(tǒng)方法進行完善：一是手術操作中對組織的損傷盡可能減小，穿刺時盡量避開肉眼可見血管，以防頸部出血壓迫窒息；二是改變封管的方法，用500 IU肝素和300 g/L的PVP-10聚乙烯吡咯烷黏稠溶液封管1周后再通的概率能提高70%～80%。兩方面聯(lián)合改進，降低了實驗成本，增強了實驗數據穩(wěn)定性。因此，本改進方法具有一定可行性和可靠性。胰島素抵抗是2型糖尿病的特征，研究表明血漿FFA濃度增加在胰島素抵抗的發(fā)病機制中起著重要的作用[6]。國內多采用高脂喂養(yǎng)方式制備脂毒性大鼠胰島素抵抗模型，但長期高脂飲食可刺激大鼠代償性分泌一些胃腸激素激活脂蛋白酯酶（LPS），從而減輕胰島素抵抗[7]。不同于此種方法，筆者采用短期6 h輸注脂肪乳使FFA升高，直接觀察高FFA對大鼠胰島素敏感性的影響，同時采用經典的HEC技術評價胰島素抵抗。結果發(fā)現，大鼠輸注20%脂肪乳6 h后，血漿FFA水平升高17.6倍，同時GIR下降了27%，成功復制了大鼠脂毒性胰島素抵抗模型。此實驗結果與之前通過輸注脂肪乳從而建立胰島素抵抗模型的數據基本一致[8]。

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[2]Camacho RC,Zafian PT,Achanfuo-Yeboah J,et al.Pegylated Fgf21 rapidly normalizes insulin-stimulated glucose utilization in diet-induced insulin resistant mice[J].Eur J Pharmacol,2013，715（1-3）：41-45.

[3]李玲.大鼠清醒和麻醉狀態(tài)下胰島素鉗夾實驗結果的比較[J].中國糖尿病雜志,2003,11(1):51-53.

[4]Kraegen EW,James DE,Bennett SP,et al.In vivo insulin sensitivi?ty in the rat determined by euglycemic clamp[J].Am J Physiol,1983,245(1):E1-7.

[5]羅四川,李啟富,劉紅梅.清醒狀態(tài)大鼠高胰島素一正常血糖鉗夾術的建立及其意義[J].重慶醫(yī)科大學學報,2004,29(3):334-336.

[6]Capurso C，Capurso A.From excess adiposity to insulin resistance:the role of free fatty acids[J].Vascul Pharmacol,2012,57(2-4):91-97.

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[8]Griffin ME,Marcucci MJ,Cline GW,et al.Free fatty acid-induced insulin resistance is associated with activation of protein kinase C theta and alterations in the insulin signaling cascade[J].Diabetes,1999,48(6):1270-1274.