熊建軍， 江 和， 許曉源， 周小鷗， 王 庭， 李衛(wèi)東

Importin 8(IPO8)是在1997年發(fā)現(xiàn)的核質(zhì)轉(zhuǎn)運受體 importin β 家族成員［1］。有研究認為，IPO8 是一個在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達的基因，在多種腫瘤細胞中作為內(nèi)參照基因用于PCR檢測［2-3］，但是另一些研究顯示IPO8蛋白的功能并不局限于核質(zhì)轉(zhuǎn)運。研究發(fā)現(xiàn)，IPO8與胞質(zhì)內(nèi)miRNA介導(dǎo)的基因沉默有內(nèi)在聯(lián)系，抑制IPO8表達導(dǎo)致部分miRNA靶基因的上調(diào)［4］，表明IPO8的表達對于細胞具有重要的意義。前期研究中我們克隆了IPO8基因啟動子，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄起始點上游-386 bp存在一處CCT的3堿基插入/缺失變異(rs35100176)。本研究通過 PCR、測序、瞬時轉(zhuǎn)染、雙螢光素酶檢測及real-time PCR技術(shù)研究IPO8基因啟動子區(qū)rs35100176多態(tài)位點3堿基CCT插入/缺失對基因表達的影響。

材料和方法

1 DNA樣本、試劑和材料

49例DNA樣本隨機取自九江學(xué)院附屬醫(yī)院體檢血樣。質(zhì)粒pGL3-Basic及pRL-TK為Promega產(chǎn)品;real-time PCR試劑、LATaq酶、pMD18-T載體和限制性內(nèi)切酶Mlu I、Bgl II等購自大連寶生物公司;基因組抽提試劑盒購自北京天為時代公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco;轉(zhuǎn)染試劑Fugene 6.0及雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega;大腸桿菌 DH5α、人宮頸癌細胞HeLa、人胚胎腎細胞HEK293和人骨肉瘤細胞Saos-2均由本實驗室保存;所有引物均由廣州英駿生物公司合成。

2 方法

2.1 IPO8基因啟動子區(qū)包含rs35100176多態(tài)位點序列的擴增 基因組DNA采用天根生物公司試劑盒提取。根據(jù)GenBank所公布的人IPO8基因序列(Gene ID:10526)設(shè)計引物，PCR擴增342 bp的啟動子區(qū)域，見圖 1。引物序列為 5′-ATTTGGGCTGGAAGGCAGGA-3′和 5′-TGTATGGGCATCGCAACTGG-3′。

Figure 1.The position of rs35100176 polymorphism in IPO8 promoter.圖1 多態(tài)性位點rs35100176在IPO8啟動子中的位置

2.2 PCR產(chǎn)物的測序 PCR產(chǎn)物由英駿生物技術(shù)公司測序，測序引物為 5′-ATTTGGGCTGGAAGGCAGGA-3′。

2.3 構(gòu)建IPO8基因啟動子區(qū)rs35100176位點CCT插入型和缺失型螢光素酶報告基因載體 以CCT插入純合子的個體基因組DNA和CCT缺失純合子的個體基因組DNA為模板，分別擴增IPO8基因啟動子區(qū)域(-1 330～+134)，反應(yīng)參數(shù)為:95℃ 3 min;95℃15 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30 次;72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物分別連接入pMD-18T，測序;引物序列為5′-TTCCACGCGTTGTGGCTCGCTTCTTCAGTG-3′和 5′-AAGGAGATCTCGACCCCTGGATTACCTCAC-3′。

2.4 pGL3-3N Insertion和pGL3-3N Deletion重組表達載體的構(gòu)建 用Mlu I和Bgl II雙酶切獲得測序正確的3N Insertion/T和3N Deletion/T序列，與螢光素酶表達載體pGL3-Basic經(jīng)T4 DNA連接酶4℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌。挑選陽性菌落過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒、酶切鑒定并測序。重組質(zhì)粒命名為pGL3-3N Insertion和pGL3-3N Deletion。

2.5 細胞的瞬時轉(zhuǎn)染與螢光素酶的檢測 方法如文獻［5］所述。轉(zhuǎn)染前1 d將細胞接種于24孔板，密度為1×105，無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)，至次日進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑使用Fugene 6.0(操作按照說明書進行)。每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染設(shè)3個復(fù)孔，將pGL3-3N Insertion和pGL3-3N Deletion質(zhì)粒各1 μg分別與內(nèi)參質(zhì)粒 pRL-TK 0.1 μg共轉(zhuǎn)染各孔。轉(zhuǎn)染24 h后吸去孔中的培養(yǎng)基，PBS洗滌培養(yǎng)孔，每孔中加入100 μL被動裂解液(passive lysis buffer，PLB)，室溫搖動孵育15 min，充分溶解轉(zhuǎn)染細胞，吸取細胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，13 000×g離心5 min，吸取上清液，上機檢測(操作按雙螢光素酶報告分析系統(tǒng)說明書)，分別檢測得到螢火蟲螢光素酶Luc和海腎螢光素酶RL的活性，二者的比值即為相對螢光素酶活性。

2.6 Real-time PCR 方法如文獻［6］所述。引物序列如下:IPO8 為 5′-TGTTCAGCTCCTTCCTGATTC-3′和 5′-CTTCTTACACTTCCACCATAC-3′;GAPDH 為 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′和 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 12.0分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 IPO8基因啟動子區(qū)rs35100176多態(tài)位點的測序

對49例隨機取得的DNA樣本進行測序分析，發(fā)現(xiàn)rs35100176多態(tài)位點在普通人群基因組中有3種基因型存在，分別是純合插入CCT/CCT，純合缺失-/-，雜合型CCT/-。同時我們還發(fā)現(xiàn)，在CCT多態(tài)性位點上游，還存在一個重復(fù)的CCT序列，見圖2。

Figure 2.The sequencing results of rs35100176 polymorphism in the promoter region of IPO8 gene.A:CCT deletion homozygote;B:CCT insertion homozygote;C:CCT insertion/deletion heterozygote.圖2 IPO8基因啟動子區(qū)rs35100176多態(tài)位點的測序結(jié)果

2 測序樣本中IPO8基因啟動子區(qū)rs35100176多態(tài)位點的基因分布頻率

通過對隨機取得的DNA樣本進行測序分析，發(fā)現(xiàn)在49例樣本中CCT/CCT純合型插入有9例，分布頻率為18.37%，-/-純合缺失型的有13例，分布頻率為26.53%，雜合型CCT/-有27例，分布頻率為55.10%。

3 pGL3-3N Insertion和pGL3-3N Deletion重組表達載體重組質(zhì)粒的鑒定

Mlu I與Bgl II雙酶切各IPO8啟動子片段，插入質(zhì)粒pGL3-Basic多克隆位點，轉(zhuǎn)化DH5α，構(gòu)建重組螢光素酶報告基因質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，結(jié)果表明亞克隆片段與目標(biāo)序列的理論序列完全一致，質(zhì)粒構(gòu)建正確，見圖3。

4 不同質(zhì)粒中螢光素酶報告基因的相對活性

雙螢光素酶報告基因活性檢測結(jié)果顯示，在He-La和HepG2細胞中，pGL3-3N Insertion啟動下游報告基因表達的相對活性與pGL3-3N Deletion相比顯著減弱，兩者存在顯著差異(P＜0.05)，見圖4。

Figure 3.Identification of recombinant pGL3-IPO8 promoter by restriction enzyme digestion.1:pGL3-3N Insertion digested by Mlu I and Bgl II;M:DL10000 DNA marker;2:pGL3-3N Deletion digested by Mlu I and Bgl II.圖3 重組質(zhì)粒pGL3-IPO8 promoter的酶切鑒定

Figure 4.The relative luciferase activity of transfected plasmids in HeLa and HepG2 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs pGL-3N Deletion.圖4 不同轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中報告基因在HeLa和HepG2細胞中的相對活性

5 不同表型細胞株中IPO8 mRNA的表達

根據(jù)測序結(jié)果，選擇3種不同基因型細胞株HEK293(CCT/CCT)、HeLa(CCT/-)和 Saos-2(-/-)，對其中IPO8 mRNA的表達量進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與螢光素酶檢測結(jié)果相對應(yīng)的是，在CCT純合插入的HEK293細胞，其IPO8 mRNA表達量顯著低于CCT純合缺失的人骨肉瘤細胞Saos-2(P＜0.05)，CCT雜合的HeLa細胞的IPO8 mRNA表達量則介于兩者之間，見圖5。

Figure 5. The relative mRNA expression of IPO8 among HEK293，HeLa，and Saos-2 cell lines and corresponding genotypes of rs35100176 polymorphisms.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs Saos-2.圖5 rs35100176位點不同基因型細胞株中IPO8 mRNA的相對表達量

討 論

核轉(zhuǎn)運受體包括importin α和importin β 2個家族，在蛋白的主動運輸過程中發(fā)揮了決定性作用。Importin α、β分別識別不同的蛋白核定位信號，介導(dǎo)不同類型核蛋白入核［7］。本項研究中的IPO8即是importin β家族成員之一，其基因定位于人類常染色體的12p11.21。

有研究報道，IPO8是一個穩(wěn)定表達的基因，在多種腫瘤細胞中作為內(nèi)參照基因用于PCR檢測［2-3，8］。但是另一些研究顯示IPO8的功能并不局限于核質(zhì)轉(zhuǎn)運。研究發(fā)現(xiàn)，IPO8與胞質(zhì)內(nèi)miRNA介導(dǎo)的基因沉默有內(nèi)在聯(lián)系，抑制IPO8表達導(dǎo)致部分miRNA靶基因的上調(diào)，其原因在于IPO8是argonaute(Ago)蛋白重要的調(diào)節(jié)因素［4］。Ago蛋白在所有已知的小RNA沉默通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其選擇性地與miRNA和siRNA結(jié)合，并與Dicer酶相互作用，介導(dǎo)靶mRNA的降解［9］。在這一過程中，IPO8蛋白與Ago蛋白相互作用是介導(dǎo)后者與靶miRNA結(jié)合的必經(jīng)環(huán)節(jié)。這一結(jié)果說明IPO8的表達對于細胞具有重要的意義。

在研究IPO8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制中，我們將克隆的IPO8啟動子片段與PubMed公布的序列比對，發(fā)現(xiàn)獲取的IPO8基因5′端啟動子區(qū)-386 bp處存在一個CCT的插入/缺失多態(tài)性位點。通過隨機抽取的49份人DNA樣本測序，發(fā)現(xiàn)該位點的基因分布頻率分別為:CCT/CCT(18.37%)、-/-(26.53%)和CCT/-(55.10%)。盡管該位點已被 PubMed的SNP庫收錄，編號rs35100176，但是其功能研究尚未見報道。

基因調(diào)控區(qū)的多態(tài)性不同于蛋白編碼區(qū)的堿基變異，并非引起相關(guān)蛋白分子功能的改變，但卻引起受調(diào)控基因表達量的改變［10］。通過雙螢光素酶檢測，我們發(fā)現(xiàn)CCT插入的IPO8啟動子片段活性要明顯弱于CCT缺失的片段，表明該位點在基因轉(zhuǎn)錄過程中起負性調(diào)控作用。進一步，我們通過分析該多態(tài)性位點兩端序列，發(fā)現(xiàn)CCT多態(tài)性位點上游存在CCT重復(fù)序列，由此構(gòu)成的重復(fù)序列可能是影響IPO8基因轉(zhuǎn)錄活性的原因之一。隨后，我們利用real-time PCR檢測3種不同基因表型細胞株中IPO8 mRNA相對表達量。與螢光素酶檢測結(jié)果相對應(yīng)的是，在CCT純合插入的HEK293細胞，其IPO8 mRNA表達量顯著低于CCT純合缺失的人骨肉瘤細胞Saos-2。一系列結(jié)果表明，rs35100176位點的CCT堿基插入變異能顯著抑制啟動子活性，從而影響IPO8基因的轉(zhuǎn)錄。

早在1999年，CCTCCT序列就被發(fā)現(xiàn)是一個轉(zhuǎn)錄抑制元件，在骨細胞中，CCTCCT序列是osteocalcin基因負性調(diào)控元件［11］;而在小鼠的免疫細胞，CCTCCT序列則導(dǎo)致IL-10轉(zhuǎn)錄下調(diào)，其中涉及的機制較為復(fù)雜。一些研究表明，CCTCCT是一個非典型的Sp1結(jié)合序列，Sp1與該序列結(jié)合抑制下游基因表達［12］。然而Sp1并非是CCTCCT元件唯一的反式作用因子，轉(zhuǎn)錄因子δEF1也被認為可以與CCTCCT結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程［13］。但是與IPO8基因啟動子區(qū)CCTCCT序列結(jié)合的反式作用因子尚不清楚。

盡管本文未能就CCTCCT元件參與調(diào)控IPO8轉(zhuǎn)錄的機制進行詳盡揭示，但是對傳統(tǒng)的認為IPO8是一個穩(wěn)定表達的內(nèi)參照基因的觀點提出不同見解，認為其啟動子區(qū)的多態(tài)性與基因轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)，并且可能與某些疾病具有內(nèi)在的聯(lián)系。

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