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        c-Myc抑制劑10058-F4對伊馬替尼耐藥細胞的增殖抑制作用*

        2014-11-08 02:28:04龍梓潔方志剛潘曉娜范蕊芳林東軍
        中國病理生理雜志 2014年9期
        關(guān)鍵詞:伊馬替尼細胞周期克隆

        龍梓潔, 方志剛, 潘曉娜, 范蕊芳, 林東軍

        慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤,其產(chǎn)生的大量白細胞在骨髓內(nèi)聚集,抑制骨髓的正常造血。目前,酪氨酸激酶小分子抑制劑伊馬替尼(imatinib)已經(jīng)成為治療CML的一線用藥,使得CML患者的5年生存率明顯提高,但是仍有部分患者對伊馬替尼缺乏敏感性,產(chǎn)生耐藥或復(fù)發(fā)[1]。因此,尋找新的有效治療方法克服CML對伊馬替尼的耐藥性成為當前迫切需要解決的問題。

        myc基因編碼的蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。人類 c-myc基因定位于 8q24,c-Myc蛋白與Max蛋白形成異二聚體,異二聚體與靶基因的E-box DNA(5’-CACGTG-3’)區(qū)域結(jié)合,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能,調(diào)節(jié)下游基因[2]。c-Myc蛋白參與細胞的生長、增殖、凋亡、分化、腫瘤形成及腫瘤耐藥等各個過程,并參與了多種信號通路的調(diào)控,包括 Wnt/β-catenin、phosphatidylinositol 3-kinase/Akt(PI3K/Akt)和Ras GTPase/MAP kinase(Ras/MAPK)等。在乳腺癌、前列腺癌、胃腸道腫瘤和黑色素瘤等多種實體瘤以及血液腫瘤中均發(fā)現(xiàn)c-Myc的異常表達,且與腫瘤的分期和預(yù)后相關(guān)[3]。研究報道c-Myc在白血病的發(fā)病及疾病進程中起關(guān)鍵作用[4]。鑒于c-Myc作為腫瘤治療靶點的潛在性,各研究機構(gòu)紛紛致力于c-Myc小分子抑制劑的研發(fā)。其中,10058-F4在多種腫瘤如肝癌以及白血病研究中均顯現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果[5-6]。本文旨在探討c-Myc小分子抑制劑10058-F4對K562及伊馬替尼耐藥的K562/G細胞的抑制作用,從而為臨床上治療CML提供新的治療策略。

        材料和方法

        1 主要試劑

        胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco,c-Myc小分子抑制劑10058-F4、c-Myc抗體及GAPDH抗體為Santa Cruz產(chǎn)品,甲磺酸伊馬替尼為Selleckchem產(chǎn)品,甲基纖維素為R&D產(chǎn)品,其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

        2 主要方法

        2.1 細胞培養(yǎng) K562細胞(購自American Type Culture Collection)及伊馬替尼耐藥的K562/G細胞(由K562細胞通過逐漸增加伊馬替尼濃度培養(yǎng)篩選得到)用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞進行實驗并根據(jù)實驗需要分組。

        2.2 Western blotting檢測蛋白的表達水平 用細胞裂解液[20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5),150 mmol/L NaCl,0.25%NP40,2.5 mmol/L sodium pyprophosphate,1 mmol/L EGTA,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L βglycerophosphate,1 mmol/L Na3VO4,1 mmol/L PMSF,1 mg/L leupeptin]提取K562及K562/G細胞總蛋白。用考馬斯亮藍法進行蛋白定量后,等量蛋白上樣,10%SDS-PAGE進行蛋白分離,將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,I抗孵育,4℃過夜,HRP標記的II抗孵育1 h,于暗室中曝光。以glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)作為內(nèi)參照。

        2.3 MTT法檢測細胞增殖情況 K562及K562/G細胞培養(yǎng)于96孔板,分別進行不同的處理,檢測前每孔加入20 μL MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h,離心棄上清液后,每孔加入150 μL DMSO溶解沉淀,于490 nm波長的酶標儀測定吸光度。

        2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 收集細胞后,1 500 r/min離心5 min,PBS洗滌2次,后用70% 冰乙醇固定過夜,碘化丙啶 (propidium iodide,PI)染色后流式細胞儀測定細胞周期。

        2.5 甲基纖維素克隆形成實驗 對照組及藥物處理組細胞(K562及K562/G)分別培養(yǎng)于甲基纖維素中,37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)6 d后顯微鏡下觀察克隆。

        2.6 Annexin V-PI染色檢測細胞凋亡 K562及K562/G細胞分別進行不同的處理,檢測前每孔用500 μL binding buffer 重懸,加入 5 μL Annexin VFITC及5 μL PI,避光孵育15 min后流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

        3 統(tǒng)計學(xué)處理

        數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,組間比較分析用t檢驗或方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 伊馬替尼對K562及K562/G細胞的作用

        將K562及K562/G細胞培養(yǎng)于96孔板,分別用不同劑量(0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L)的伊馬替尼進行處理,48 h后MTT法檢測細胞的增殖情況。與對照組相比,伊馬替尼可劑量依賴性地抑制K562及K562/G細胞的增殖。K562細胞對伊馬替尼較敏感,而K562/G在同樣劑量的伊馬替尼處理下出現(xiàn)耐藥。1 μmol/L的伊馬替尼作用下,K562細胞的存活率是53.9% ±2.0%,K562/G的存活率為77.4% ±5.9%(P<0.01),見圖1A。Western blotting實驗結(jié)果顯示,K562/G細胞比K562細胞表達更高的c-Myc蛋白,見圖1B。

        2 c-Myc抑制劑10058-F4對K562及K562/G細胞增殖及周期的影響

        由于c-Myc在K562/G細胞中具有較高的表達,為了驗證c-Myc靶向抑制劑10058-F4對耐藥細胞的作用,10058-F4 以不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)及不同時間(0、24、48、72 h)作用于K562及K562/G細胞,MTT法分析10058-F4對白血病細胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示:與對照組相比,10058-F4對K562及K562/G細胞均有抑制作用,且呈劑量和時間依賴性,并且對耐藥的K562/G細胞較K562細胞抑制作用更強,耐藥細胞對10058-F4更敏感,見圖2。50 μmol/L的10058-F4作用48 h,K562及K562/G細胞的存活率分別為73.3%±3.2%及63.7%±3.0%;100 μmol/L 的 10058-F4 作用 48 h,K562 及K562/G細胞的存活率分別為61.7%±3.6%及42.0%±3.2%,與對照組相比均具有顯著差異(P<0.01)。流式細胞術(shù)檢測K562及K562/G細胞周期結(jié)果顯示,10058-F4能阻滯細胞于G0/G1期(圖3),因此10058-F4對細胞增殖的抑制作用可能與細胞周期的阻滯相關(guān)。

        Figure 2.10058-F4 inhibited proliferation of K562 and K562/G cells.A:K562 and K562/G cells were treated with various concentrations of 10058-F4 for 48 h and then subjected to MTT assay;B:K562 and K562/G cells were treated with 50 μmol/L 10058-F4 for indicated time and then subjected to MTT assay.Mean±SD.n=3. **P <0.01 vs 0 μmol/L or 0 h.圖2 10058-F4抑制K562及K562/G細胞的增殖

        3 c-Myc抑制劑10058-F4促進K562及K562/G細胞凋亡

        100 μmol/L的10058-F4處理 K562及 K562/G細胞48 h后,Annexin V-PI染色并采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,結(jié)果表明10058-F4可促使K562及K562/G細胞發(fā)生凋亡,見圖4。

        4 c-Myc抑制劑10058-F4對K562及K562/G細胞克隆形成能力的影響

        克隆形成實驗結(jié)果顯示,相對于K562細胞,K562/G細胞表現(xiàn)出更強的克隆形成能力(P<0.01),見圖5。伊馬替尼對于K562細胞的抑制作用明顯大于K562/G細胞(P<0.01),進一步表明K562/G細胞對伊馬替尼的耐藥性。10058-F4可抑制K562及 K562/G細胞的克隆形成能力,且對K562/G細胞的作用更加顯著(P<0.01)。10058-F4與伊馬替尼聯(lián)合作用于細胞6 d后,兩藥聯(lián)用組比對照組及單藥組作用效果更加明顯,提示10058-F4可以逆轉(zhuǎn)K562/G細胞對伊馬替尼的耐藥性。

        Figure 3.10058-F4 induced cell cycle arrest in K562 and K562/G cells.K562 and K562/G cells were treated with 50 μmol/L 10058-F4 for 48 h and then subjected to flow cytometry for cell cycle analysis.Mean±SD.n=3.**P <0.01 vs control.圖3 10058-F4導(dǎo)致K562及K562/G細胞周期阻滯

        討 論

        作為腫瘤治療的潛在靶點,c-Myc在人類多種實體腫瘤及血液腫瘤中異常高表達。研究報道,c-Myc的異常表達可促進腫瘤的形成和進展[7];抑制c-Myc的表達可抑制腫瘤細胞生長,促進細胞凋亡、衰老和分化。更重要的是,c-Myc的高表達在白血病發(fā)生過程中起關(guān)鍵的作用[8],抑制c-Myc能夠阻止白血病的發(fā)生[9]。c-Myc通過調(diào)節(jié)一系列下游基因決定細胞的存活。c-Myc在CML患者的CD34+造血前體細胞中通過調(diào)控ATP-binding cassette(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白的基因轉(zhuǎn)錄從而導(dǎo)致細胞對化療藥物的耐藥[10]。另外,c-Myc可調(diào)節(jié)多種micro RNA,包括增加促進腫瘤發(fā)生的microRNA及降低腫瘤抑制作用的micro-RNA的表達。在K562細胞中,c-Myc可通過調(diào)控miR-144/451的表達使K562細胞獲得對伊馬替尼的抗藥性[11]。

        Figure 4.10058-F4 induced apoptosis of K562 and K562/G cells.K562 and K562/G cells were treated with 100 μmol/L 10058-F4 for 48 h and then subjected to flow cytometry for Annexin V-PI analysis.Mean±SD.n=3. **P <0.01 vs control.圖4 10058-F4促進K562及K562/G細胞發(fā)生凋亡

        本研究發(fā)現(xiàn)c-Myc表達上調(diào)是耐藥細胞克隆形成能力增強的細胞遺傳學(xué)特征之一,c-Myc的高表達可能導(dǎo)致K562/G細胞對于伊馬替尼的敏感性降低。c-Myc抑制劑10058-F4可抑制K562及K562/G細胞的增殖,并且對K562/G細胞表現(xiàn)出更強的殺傷作用,可能與其高表達c-Myc相關(guān)。細胞周期檢測顯示10058-F4能阻滯細胞于G0/G1期,因此10058-F4抑制細胞增殖可能與細胞周期阻滯相關(guān),與之前的研究結(jié)果一致[6]。同時,10058-F4可促進K562及K562/G細胞發(fā)生凋亡。此外,細胞克隆形成實驗顯示,K562/G細胞對10058-F4具有更高的敏感性。在肝癌[5]、肺癌[12]及黑色素瘤[13]的研究中,抑制 c-Myc的表達可增強細胞對化療藥物的敏感性。我們的研究發(fā)現(xiàn)10058-F4可恢復(fù)耐藥K562/G細胞對于伊馬替尼的敏感性,減少細胞的克隆形成數(shù)目。因此,高表達c-Myc的K562/G細胞可能通過上調(diào)c-Myc的表達增強對伊馬替尼的抵抗作用,提高細胞的耐藥性。10058-F4作為一個有效的c-Myc的小分子抑制劑,可殺傷白血病細胞,逆轉(zhuǎn)耐藥。

        Figure 5.10058-F4 supressed colony formation of K562 and K562/G cells.K562 and K562/G cells were treated with 50 μmol/L 10058-F4 or/and 1 μmol/L imatinib for 6 d and subjected to colony formation analysis(×100).**P<0.01 vs K562;##P<0.01 vs imatinib.圖5 10058-F4抑制K562及K562/G細胞的克隆形成能力

        本實驗初步分析了c-Myc對CML耐藥細胞特性的影響。結(jié)果表明c-Myc在CML細胞耐藥性中起重要作用,c-Myc的小分子抑制劑可有效殺傷K562細胞及伊馬替尼耐藥的K562/G細胞,預(yù)示通過抑制c-Myc的表達可以克服CML治療過程中的耐藥問題,為臨床提供新的治療策略。

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