蔣樹海，楊發(fā)青，崔迎進(jìn)，王程飛，許俊艷，周鴻銳

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457 ； 2. 天津中新科炬生物制藥有限公司，天津 300092）

基于免疫層析的C R P定量檢測(cè)試劑研制

蔣樹海1，楊發(fā)青2，崔迎進(jìn)2，王程飛2，許俊艷2，周鴻銳2

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457 ； 2. 天津中新科炬生物制藥有限公司，天津 300092）

目的基于免疫層析技術(shù)，研制一種C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）定量檢測(cè)試劑。方法采用雙抗體夾心法，通過(guò)嚴(yán)格的原輔料篩選和生產(chǎn)工藝控制研制試劑，用基于光學(xué)定量的免疫層析結(jié)果判讀記錄儀進(jìn)行定量檢測(cè)，最后進(jìn)行性能分析和臨床試驗(yàn)。結(jié)果 研制出了定量檢測(cè)試劑，功能靈敏度≤1 mg/L，CV≤15%，線性范圍1～200 mg/L，室溫穩(wěn)定性12個(gè)月；經(jīng)對(duì)220份臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，總符合率為98.6%，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.987，和對(duì)照試劑性能無(wú)顯著性差異。結(jié)論 基于免疫層析技術(shù)，研制出一種操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好的CRP定量檢測(cè)試劑，可運(yùn)用于現(xiàn)場(chǎng)或臨床對(duì)CRP的快速定量檢測(cè)。

C反應(yīng)蛋白；免疫層析；定量檢測(cè)；雙抗體夾心

C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）是一種由5個(gè)相同亞單位組成的α球蛋白，在肝臟中合成，具有廣泛的生理學(xué)意義。CRP正常情況下濃度很低，在多種疾病過(guò)程中特別是細(xì)菌感染時(shí)含量會(huì)明顯增高，24～48 h內(nèi)CRP的濃度迅速上升。盡管檢測(cè)CRP上升不能作為特定疾病的指標(biāo)，但對(duì)于多種炎癥的判定具有意義[1-6]。此外，低水平的CRP與心血管疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，是心血管炎癥病變的生物標(biāo)志物，可用于心血管和外圍血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。目前CRP檢測(cè)在臨床上廣泛應(yīng)用[7-12]。

目前市場(chǎng)上CRP檢測(cè)以免疫比濁法為主，對(duì)試劑存儲(chǔ)和檢測(cè)儀器都有一定的要求[13-14]。本研究目的是開發(fā)一種基于免疫層析的CRP膠體金定量檢測(cè)試劑，操作簡(jiǎn)便、性能穩(wěn)定、適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，以滿足市場(chǎng)上差異化的需要。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)主要原材料：CRP單克隆抗體，芬蘭Hytest公司產(chǎn)品；羊抗鼠IgG：自制；CRP抗原：美國(guó)Meridian Biosciences產(chǎn)品，系從人血液樣本中純化的CRP樣本，經(jīng)標(biāo)化后作為內(nèi)控品使用；NC膜：型號(hào)HF 135，美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。其他對(duì)照品和化學(xué)試劑，從相應(yīng)有資質(zhì)的公司購(gòu)買。(2)免疫層析結(jié)果判讀記錄儀：型號(hào)NS 3001，天津中新科炬生物制藥有限公司產(chǎn)品。(3)臨床樣本：為天津第三中心醫(yī)院和泰達(dá)國(guó)際心血管病醫(yī)院就診病人采集的血液樣本。(4)臨床對(duì)照試劑：英國(guó)朗道（Randox）公司免疫比濁法CRP檢測(cè)試劑。

1.2 方法[13-16]

1.2.1 CRP抗體標(biāo)記 以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為40 nm的膠體金溶液，用0.2 M K2CO3將溶液調(diào)到pH 7.5。然后將溶液置于磁力攪拌器上攪拌，按1 mg抗體比100 mL膠體金溶液的比例將CRP標(biāo)記抗體緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌1 h，再以終濃度為0.1%的BSA和0.1%的PEG 20000進(jìn)行封閉30 min，標(biāo)記結(jié)束后以12000 g離心15 min，棄上清，沉淀按75%原體積復(fù)溶至膠體金稀釋液中。然后用噴金儀將膠體金溶液用均勻噴涂在樣品墊上，再干燥3～4 h，制成膠體金墊，干燥儲(chǔ)存。

1.2.2 CRP抗體包被 用0.01 M pH 7.4 PBS將CRP包被抗體配制成0.8 mg/mL，然后用噴膜儀將在NC膜上按1.5 uL/ cm進(jìn)行劃線包被，同時(shí)在NC膜上包被羊抗鼠IgG，用于試劑的質(zhì)控，包被完成后將NC膜在干燥間干燥3～4 h，干燥儲(chǔ)存。

1.2.3 試劑組裝 準(zhǔn)備好吸樣墊、樣品墊、PVC板、塑卡等包裝材料，在干燥條件下將PVC板中央粘貼包被好的NC膜，NC膜上緣粘貼吸樣墊，NC膜下緣粘膠體金墊，膠體金墊下緣粘貼樣品墊，然后用裁切機(jī)將貼好的PVC板切成適當(dāng)寬度的試紙條，再將試紙條裝入塑卡中，密封于鋁箔袋中，完成檢測(cè)卡組裝。

1.2.4 內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 將CRP抗原用Randox免疫比濁法CRP檢測(cè)試劑進(jìn)行測(cè)定標(biāo)化后，配制成1、3、10、50、100、200 mg/L的內(nèi)控品，用制備好的試劑檢測(cè)，用免疫層析結(jié)果判讀記錄儀讀取檢測(cè)線的光學(xué)GOD值，將濃度和GOD值按最小二乘法擬合曲線，再輸入到免疫層析結(jié)果判讀記錄儀中，成為內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 檢測(cè)方法 取10μL血清或血漿樣本，或20μL全血樣本，加入檢測(cè)卡S孔中，再于B孔中加入80μL樣本稀釋液，15～20 min內(nèi)用免疫層析結(jié)果判讀記錄儀檢測(cè)，通過(guò)儀器內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本含量。

1.2.6 分析性能評(píng)估 分別應(yīng)用CRP內(nèi)控品、含干擾物質(zhì)樣本等對(duì)檢測(cè)試劑進(jìn)行相應(yīng)的測(cè)試，評(píng)估試劑的功能靈敏度、檢測(cè)范圍、精密度、特異性和穩(wěn)定性。

1.2.7 臨床試驗(yàn)：在天津第三中心醫(yī)院和泰達(dá)國(guó)際心血管病醫(yī)院進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)樣本220份臨床血清樣本，采用英國(guó)朗道（Randox）公司免疫比濁法CRP檢測(cè)試劑作為對(duì)照。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 檢測(cè)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0等軟件，進(jìn)行配對(duì)卡方檢驗(yàn)、Kappa一致性分析、線性回歸和Bland-Altman等分析考核試劑的臨床符合率、相關(guān)性、一致性。同時(shí)檢測(cè)來(lái)自于同一病人血清、血漿和全血樣本各50份，考核試劑對(duì)不同樣本的檢測(cè)能力。

2 結(jié)果

2.1 功能靈敏度、檢測(cè)范圍、精密度和準(zhǔn)確度 以CRP質(zhì)控品為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)制備的試劑進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行檢測(cè)10次，檢驗(yàn)結(jié)果如下（見表1）。

表1 試劑對(duì)不同濃度CRP內(nèi)控品檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Result of the kit tested with CRP inner control samples

表1是對(duì)批制備的一批試劑檢測(cè)結(jié)果，其他批次檢測(cè)結(jié)果類似。可以看出，以變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）≤20%作為功能靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)，試劑的功能靈敏度可達(dá)到1 mg/L。以r＞0.975、CV＜15%作為定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，在1～200 mg/L范圍內(nèi)，計(jì)算r=0.996，符合標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)可以看出，在1～200 mg/L范圍內(nèi)，檢測(cè)的偏差＜15%，準(zhǔn)確度達(dá)到定量試劑標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.2 分析特異性 對(duì)不同類型的樣本進(jìn)行檢測(cè)，同類型的樣本各檢測(cè)5份，樣本均來(lái)自于醫(yī)院進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)后的剩余樣本。用考核試劑和對(duì)照試劑同時(shí)對(duì)其CRP含量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)樣本若同時(shí)為陰性或偏差＜15%，則結(jié)果符合要求。結(jié)果表明，考核試劑對(duì)PCT≤20 ng/mL、AFP≤400 ng/mL、CEA≤400 ng/ mL，cTnI≤50 ng/mL無(wú)交叉反應(yīng)；血紅蛋白≤6 mg/mL，甘油三脂≤15 mg/mL，膽紅素≤0.2 mg/mL對(duì)檢測(cè)無(wú)明顯影響；肝素、EDTA和枸椽酸鈉抗凝血對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。

2.3 穩(wěn)定性 試劑盒在室溫條件下保存至15個(gè)月，定期測(cè)試，結(jié)果表明性能無(wú)明顯變化，性能符合產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。說(shuō)明試劑的穩(wěn)定性較好，穩(wěn)定性應(yīng)該在12個(gè)月以上。

2.4 臨床試驗(yàn)

2.4.1 對(duì)220份血清樣本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，樣本基本情況如下（見表2）。

表2 臨床樣本基本情況簡(jiǎn)介(n=220)Tab.2 Summary of clinical trail samples(n=220)

以對(duì)照試劑的檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，可以看出，樣本的值在1.00～184.00 mg/L內(nèi)分布，較為離散，能反應(yīng)實(shí)際臨床樣本分布的情況。

2.4.2 臨床定性分析 對(duì)220份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)后，以10 mg/L作為感染參考值，檢測(cè)結(jié)果如果下（見表3）。

表3 臨床對(duì)比檢測(cè)結(jié)果(n=220)Tab 3 Comparison result of testes with trail samples(n=220)

從上圖可知，陽(yáng)性符合率=53/53=100.00%(93.28%～100.00%)；陰性符合率=164/167=98.20%(94.84%～99.63%)；總符合率=217/220=98.64% (96.07%～99.72%)；配對(duì)卡方檢驗(yàn)(精確概率法)：χ2=0.25，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；一致性檢驗(yàn)：Kappa= 0.963， 一致性較好。

2.4.3 臨床定量分析 對(duì)220份血清樣本的檢測(cè)值分析，結(jié)果如下。Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.987；F=7952.69，P＜0.001，直線關(guān)系成立。Bland-Altam分析[5]，220對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)有206(93.6%)對(duì)落在1.96 SD界內(nèi)，均為高值樣本（見圖1）。

圖1 Bland-Altam分析圖Fig.1 The map of Bland-Altam analysis

2.4.4 血清、血漿和全血的一致性分析 對(duì)來(lái)自于同一病人血清、血漿和全血樣本各50份樣本進(jìn)行檢測(cè)后，進(jìn)行直線回歸和相關(guān)分析，血清血漿對(duì)比，r=0.989；血清和全血對(duì)比，r= 0.991。說(shuō)明對(duì)血清、血漿和全血檢測(cè)的一致性良好。

3 討論

近年來(lái)，膠體金技術(shù)用于定性試劑的臨床檢測(cè)已得到廣泛的認(rèn)可[17-18]。然而在定量檢測(cè)上存在難度，進(jìn)入臨床應(yīng)用的試劑以進(jìn)口試劑為主。根據(jù)國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求，定量試劑的準(zhǔn)確性和精密度需要控制在15%以內(nèi)，線性范圍內(nèi)r值無(wú)強(qiáng)制要求，但一般應(yīng)不低于0.95[7]。

本研究以CRP對(duì)象，采用免疫層析膠體金技術(shù)研制開發(fā)定量檢測(cè)試劑，從結(jié)果分析看，試劑的精密度、準(zhǔn)確度和相關(guān)系數(shù)r均達(dá)到定量試劑的一般要求，成功研制出定量檢測(cè)試劑；試劑的功能靈敏度、線性范圍和穩(wěn)定性和已市的相關(guān)試劑相比，能滿足臨床需要。在臨床試驗(yàn)中，定性分析結(jié)果良好；定量分析除Bland-Altam分析外，各項(xiàng)數(shù)據(jù)結(jié)果良好。Bland-Altam分析中，少量的高值樣本絕對(duì)偏差稍大，但如果分析相對(duì)偏差并不大，結(jié)果可以接受。并且高值均表示較為嚴(yán)重的炎癥或感染，不影響臨床結(jié)果判定。

在本試劑的研究中，我們總結(jié)出以下幾個(gè)關(guān)鍵因素：(1)將檢測(cè)線的膠體金光學(xué)信號(hào)定量化，需要有靈敏、可靠的檢測(cè)儀器[19-20]。目前市場(chǎng)上相關(guān)儀器種類少，且大多不兼容。本產(chǎn)品采用本公司自主開發(fā)的通用型免疫層析判讀記錄儀[9-10]，很好地解決了此問(wèn)題。(2)需要對(duì)原輔材料和工藝進(jìn)行嚴(yán)格的控制，以減少批內(nèi)差異。經(jīng)本研究檢測(cè)，如果按一般的膠體金方法生產(chǎn)試劑，將結(jié)果轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)后，CV高于50%。其中NC膜本身的均一性、膠體金顆粒的大小、制備膠體金墊的均一性和組裝過(guò)程中各個(gè)粘貼接頭的嚴(yán)密程度均影響檢測(cè)結(jié)果的CV值。只有采用更為嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和工藝改進(jìn)可以將CV降低到15%以內(nèi)。(3)免疫層析法試劑需要樣本將膠體金溶解后在NC膜上層析并進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)，和免疫比濁等純液相反應(yīng)不同，反應(yīng)速率受膠體金溶解速度、環(huán)境的溫濕度及樣本的粘度的影響。若采用速率法判定結(jié)果則CV值較大；采用終點(diǎn)法時(shí)由于反應(yīng)較為完全，結(jié)果CV值較小，結(jié)果可信。(4)內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線雖然為檢測(cè)帶來(lái)了方便，然而各個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室由于人員操作習(xí)慣、配套器具或環(huán)境的不同，會(huì)給檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)一定的偏差，因而必要時(shí)需要進(jìn)行系統(tǒng)的校準(zhǔn)或質(zhì)控，以得到為準(zhǔn)確可信的檢測(cè)結(jié)果。

目前市面上雖然已有比濁、超敏等多種CRP檢測(cè)試劑，然而本研究的檢測(cè)試劑具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、適用血清、血漿和全血多種樣本、適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等特點(diǎn)，特別適合于中小型醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)，方便普通民眾的檢測(cè)需要。

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Development of a quantitative CRP test kit with lateral fl ow method

JIANG Shu-hai1, YANG Fa-qing2, CUI Ying-jin2, WANG Cheng-fei2, XU Jun-yan2, ZHOU Hong-rui2
(1.Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education Key Laboratory of Industrial Microbiology, College of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2.Newscen Coast Bio-pharmaceutical Co., Ltd. ,Tianjin 300457, China)

ObjectiveA kind of quantitative C reactive protein (CRP) test kit was developed with colloidal gold lateral fl ow method。MethodThe kit was prepared with double antibody sandwich technology, and by material optimization and strict process control to improve performance. Quantitative assay was realized by a specialized lateral fl ow reader. The kit performance was evaluated with series of tests and clinical trial。ResultsThe kit was developed with functional sensitivity ≤ 1 mg/L, linear range 1-200 mg/L, CV ＜15% and with stability of 12 months. 220 samples clinical trial showed 98.6% of coincidence rate. Pearson Correlation coef fi cient r is 0.987, which showed no signi fi cant difference in performance compare with control kit。ConclusionA quantitative CRP test kit was developed with easy to operating and good stability, Which can be used for point of care testing or laboratory testing.

C reactive protein; lateral fl ow; quantitative assay; double antibody sandwich

Q 819

A

1005-1678(2014)01-0076-03

天津市科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金項(xiàng)目（12ZXCXSY04600）

蔣樹海，男，博士，研究方向：代謝工程，Email：chuangxinzijin@126.com。