, , , ,

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032；2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

烏拉爾甘草(Glycyrrhizauralensis)為豆科多年生草本植物，主要分布在干旱、半干旱地區(qū)，主產(chǎn)區(qū)在內(nèi)蒙古、寧夏及甘肅，是一種重要的藥用植物資源，有“十方九草”之稱[1-2].主要含有甘草酸、甘草次酸、黃酮、生物堿、氨基酸等成分，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗菌等多種生理活性[3-4].

近年來，植物內(nèi)生菌特別是藥用植物內(nèi)生菌，作為一種新的資源引起了人們的廣泛關(guān)注，已從中分離出了多種具有抗菌、抗腫瘤、殺蟲、免疫抑制和抗氧化等作用的生物活性物質(zhì)，其中很多是具有特殊生物活性的新結(jié)構(gòu)物質(zhì)[5].王鴻等[6]從魚腥草內(nèi)生菌揮發(fā)性成分中分離到宿主活性成分的結(jié)構(gòu)類似物，表明內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主具類似生理活性的物質(zhì).當(dāng)前對烏拉爾甘草內(nèi)生真菌的研究報(bào)道較少，主要對甘草中具有抗菌活性的菌株進(jìn)行了篩選，而內(nèi)生菌的抗氧化活性篩選則未見報(bào)道.本研究旨在分離鑒定內(nèi)蒙古地區(qū)烏拉爾甘草根、莖、葉中的內(nèi)生真菌，檢測其發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性，為探明內(nèi)蒙古烏拉爾甘草的道地性以及更好地開發(fā)利用甘草及內(nèi)生菌提供參考.

1 材料與方法

1.1 材 料

烏拉爾甘草植株采自內(nèi)蒙古呼和浩特.

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：固體培養(yǎng)基用于內(nèi)生真菌的分離純化，液體用于發(fā)酵.稱取馬鈴薯約200 g，洗凈后去皮切成小塊，煮沸30 min，紗布過濾后再加15 g葡萄糖和18 g瓊脂，溶化后補(bǔ)足水分至l 000 mL，pH自然，分裝至錐形瓶后12l ℃滅菌20 min.

1.3 內(nèi)生真菌的分離與純化

分別取新鮮甘草的根、莖、葉，分別用自來水沖洗干凈，濾紙吸干水分.按下列程序進(jìn)行表面消毒處理：先用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡1 min，無菌水沖洗3遍，再用0.1%的升汞處理30 s，無菌水沖洗4次.其次在無菌條件下，用無菌的手術(shù)剪將植物根、 莖、 葉剪成小段，根和莖沿剖面剪成1～2 mm厚的片段，葉片切成3 mm×3 mm 的方塊，置于培養(yǎng)基平板上，在28 ℃下培養(yǎng)3 d.觀察外植體周圍有無菌落形成，挑取內(nèi)生菌株菌絲到PDA培養(yǎng)基中，置于28 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d.反復(fù)轉(zhuǎn)接至純培養(yǎng)后，將菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，保存至4 ℃冰箱中備用.

空白對照：將上述經(jīng)過表面消毒后未切割的樣品置入空白平板中，28 ℃下培養(yǎng)， 若材料周圍未長出雜菌，則說明所分離的菌株為內(nèi)生菌株.

1.4 內(nèi)生菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

觀察內(nèi)生菌菌落形態(tài)特征.挑取分離得到的純培養(yǎng)物，用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色，常規(guī)鏡檢，觀察內(nèi)生菌株的顯微形態(tài).參照《真菌鑒定手冊》，對分離的內(nèi)生菌株進(jìn)行分類、鑒定[7-10].

1.5 抗氧化活性篩選

1.5.1 內(nèi)生菌株發(fā)酵液清除DPPH自由基能力的測定

從PDA培養(yǎng)基上取活化的真菌適量，分別接種到100 mL錐形瓶內(nèi)50 mL液體培養(yǎng)基中，于28 ℃搖床中120 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d.發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾后，用乙酸乙酯等體積萃取3次，濃縮至干，4 ℃保存.分別精密稱取干燥恒重的各乙酸乙酯提取物5 mg，甲醇溶解并稀釋至50 mL，即100 μg/mL備用.

1) 準(zhǔn)確稱取1.971 5 mg DPPH，用甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶.

2) 分別移取各樣液0.5 mL于10 mL具塞試管中，加入0.5 mL DPPH-甲醇溶液，充分混勻，室溫靜置30 min后，測定A517(Ai)(以甲醇作參比).

3) 0.5 mL DPPH-甲醇溶液與0.5 mL甲醇溶液混合后測定A517(Ac).

4) 0.5 mL樣液與0.5 mL甲醇溶液混合后測定A517(Aj).

抗氧化能力用抑制率來表示[11]，即

1.5.2 總抗氧化能力的測定(FRAP值測定)

取各真菌發(fā)酵液，適當(dāng)稀釋后移液器取100 μL，加入FRAP工作液3 mL，混勻反應(yīng)20 min，于593 nm處讀取吸光度.以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲錢，求得回歸方程.樣品的抗氧化能力以FRAP值表示：1FRAP單位=1 μmol FeSO4，即樣品的抗氧化能力相當(dāng)于FeSO4的μmol/L數(shù)[12].

1.6 活性菌株的分子生物學(xué)鑒定

1.6.1 基因組提取

采用SK1375真菌基因組抽提試劑盒提取菌株基因組.

參照酵母26S rDNA D1/D2區(qū)引物NL1：5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’和NL2：5’- GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’[13]引物對，由上海生工公司合成.25 μL擴(kuò)增體系包括：Template(基因組)10 pmol，Primer up (10 μM) 0.5 μL，Primer down (10 μM) 0.5 μL，dNTP mix (10 Mm each) 0.5 μL，10×Taq reaction Buffer 2.5 μL，Taq (5 U/μL) 0.2 μL，加水至25 μL.PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 5 min；循環(huán)94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃下延伸8 min.擴(kuò)增完成后，將產(chǎn)物送往上海生工生物公司測序.

1.6.2 序列比較及發(fā)育樹構(gòu)建

以Colletotrichum屬26S rDNA D1/D2序列為參照，對PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在Genbank數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行同源序列搜索(blast search)，找出該菌株與數(shù)據(jù)庫中同源性最高的模式菌株，用MEGA 5.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和進(jìn)化樹構(gòu)建.

2 結(jié)果分析與討論

2.1 甘草內(nèi)生真菌的分離與鑒定

如表1所示，從甘草植株的根、莖、葉中共分離得到14株內(nèi)生真菌，其中從根中分離得到6株，從葉、莖中均分離得到4株.甘草的不同組織中，內(nèi)生菌株的種類也不同.從根中分離到的內(nèi)生菌株歸屬于3個(gè)屬，依次為鐮孢霉屬、炭疽菌屬、毛霉屬，其中毛霉屬最多.從莖中分離得到青霉屬與炭疽菌屬內(nèi)生菌株.從葉中只分離到青霉屬. 從所分離菌株的種屬來看，其中青霉屬數(shù)量最多，為優(yōu)勢菌屬.

表1 甘草組織中內(nèi)生菌株的分布

2.2 清除DPPH自由基能力的測定

對14株內(nèi)生真菌發(fā)酵液進(jìn)行清除DPPH自由基活性的測定，結(jié)果見圖1.由圖1可知：所分離獲得的菌株普遍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性.其中有4株真菌清除DPPH能力最強(qiáng)，清除率高達(dá)95%以上，分別為菌株L1-1，L2-1，R2-1，S2-1，最弱的為菌株R1-1，清除率為54%.

圖1 14株內(nèi)生真菌對DPPH自由基的清除率

2.3 FRAP法篩選

以標(biāo)準(zhǔn)品(FeSO4)溶液的吸光度值y與標(biāo)準(zhǔn)品(FeSO4)濃度x(mmol/L)進(jìn)行線性回歸，求得線性回歸方程y=0.286 9x+0.064 3，R2=0.998 4.結(jié)果表明FeSO4濃度在0～1 mmol/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系.取各真菌發(fā)酵液，適當(dāng)稀釋后移液器取100 μL，加入FRAP工作液3 mL，混勻反應(yīng)20 min，于593 nm處讀取吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得FRAP值見表2.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：總抗氧化最強(qiáng)的為S2-2；清除DPPH能力最強(qiáng)的為S2-1；綜合比較總抗氧化活性和清除DPPH能力，R2-3和L1-2 2株菌株比較突出.綜合分析DPPH法和FRAP法，中藥甘草中普遍存在具有抗氧化活性的內(nèi)生真菌，其中根中具有強(qiáng)氧化活性的菌株占33%，莖中占50%，葉中占25%.酵母屬的菌株S2-2和R2-3具有高抗氧化能力，強(qiáng)于毛霉屬菌株.甘草中不同部位分離得到的內(nèi)生真菌抗氧化能力不同，不同種屬的菌株其抗氧化活性也存在一定差異.

表2 14種內(nèi)生真菌的FRAP值1)

2.4 活性菌株分子生物學(xué)鑒定

由圖1和表2可知：內(nèi)生真菌菌株R2-3對DPPH自由基的抑制率達(dá)91.78%，F(xiàn)RAP值為298，較空白組有極顯著提高.菌株R2-3為本實(shí)驗(yàn)抗氧化活性測定最為顯著的菌株，對其進(jìn)行進(jìn)一步的分子生物學(xué)鑒定.利用26S rDNA D1/D2區(qū)引物對其進(jìn)行擴(kuò)增，得到一條約606 bp的條帶，結(jié)果見圖2.

M—標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量；1—R2-3

取PCR產(chǎn)物40 μL，由上海生工生物工程公司完成測序工作，測序結(jié)果如下：

GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAA

CCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTG

AAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGG

CCCCCCGGGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGG

ATGCTTTTGGCGCGGTGCCTTCCGAGTTCCC

TGGAACGGGACGCCATAGAGGGTGAGAGCC

CCGTACGGTTGGACACCAAGCCTGTGTAAA

GCTCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAA

TGCTGCTCAAAATGGGAGGTATATTTCTTC

TAAAGCTAAATACCGGCCAGAGACCGATAG

CGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAA

AGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAACAGCAC

GTGAAATTGTTAAAAGGGAAGCGCTTGTG

ACCAGACTTGCGCCCGGTGAATCACCCAGC

TCTCGCGGCTGGGGCACTTTGCCGGCTCAG

GCCAGCATCAGCTCGCCGTCGGGGACAAAA

GCTTCGGGAACGTAGCTCTCTTCGGGGAGT

GTTATAGCCCGCTGCACAATACCCTTCGGC

GGGCTGAGGTACGCGCTCCGCAAGGATGCT

GGCGTAATGGTCATCAGCGACCCGTCTTGA

AACACGGAC

PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，應(yīng)用相關(guān)軟件將菌株R2-3與同源性較近的代表菌株26S rDNA序列進(jìn)行多重比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3.比對分析發(fā)現(xiàn)：菌株R2-3擴(kuò)增片段的堿基序列與Colletotrichumgloeosporioides的26S rDNA序列同源性高達(dá)100%，由此證明所篩選到的抗氧化活性菌株為炭疽菌.

圖3 R2-3菌株與其他菌株親緣關(guān)系的發(fā)育樹

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)采用了兩種方法評(píng)估了14株甘草內(nèi)生菌株發(fā)酵液的抗氧化活性.DPPH法篩選出的4株內(nèi)生菌株L1-1，L2-1，R2-1，S2-1對DPPH自由基的清除率達(dá)95%以上；FRAP法檢測3株內(nèi)生菌株L1-2，S2-2，R2-3表現(xiàn)較高的還原力，F(xiàn)RAP值分別為256，309，298，占菌株總數(shù)的14.3%，其他內(nèi)生菌株也在不同程度上表現(xiàn)出一定的抗氧化活性.結(jié)果表明：甘草內(nèi)生真菌是篩選天然抗氧化活性成分或先導(dǎo)化合物的潛在資源.本次實(shí)驗(yàn)首次從烏拉爾甘草中分離到炭疽病菌，且其具有較高的抗氧化活性.炭疽菌雖為致病菌，會(huì)侵染植物造成病害，同時(shí)宿主甘草中亦存在抑菌活性物質(zhì)[14]，但兩者能在特殊的生境中形成良好的共生關(guān)系，其共生機(jī)制還有待深入研究.

參考文獻(xiàn)：

[1]王麗，劉磊，韓素貞．烏拉爾甘草內(nèi)生真菌拮抗菌株的篩選和鑒定[J]．生物技術(shù)通訊，2009(6)：155-156．

[2]劉建利，曹君邁，馬文平．寧夏烏拉爾甘草內(nèi)生茵鑒定及甜瓜采后病害病原拮抗菌的篩選[J]．干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2011，29(1)：252-253．

[3]朱緒民，邸迎彤，彭樹林，等．烏拉爾甘草中的化學(xué)成分[J]．中草藥，2003，34(3)：199-201．

[4]汪倩雯，汪琨，楊霄，等．89種中草藥醇提物體外抗菌活性的研究[J]．浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37(3)：291-293．

[5]劉霞，黨峰峰，賀曉龍，等．陜北野生甘草內(nèi)生菌的分離及抑茵活性篩選[J]．西北植物學(xué)報(bào)，2010，30(10)：2111-2112．

[6]王鴻，藍(lán)麗華，易喻，等．鮮魚腥草及其內(nèi)生菌揮發(fā)性成分分析[J]．浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40(6)：626-629．

[7]帖衛(wèi)芳，胡鳶雷，祝建波，等．甘草內(nèi)生真菌的分離及鑒定[J]．生物技術(shù)通訊，2010(9)：150-152．

[8]陳笑笑，于海寧，應(yīng)優(yōu)敏，等．仙鶴草內(nèi)生真菌的分離鑒定與抗菌活性[J]．浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(1)：40-41．

[9]霍娟，陳雙林．杜仲內(nèi)生真菌抗氧化活性[J]．南昌大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，28(3)：270-272．

[10]魏景超．真菌鑒定手冊[M]．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979．

[11]曾培源，林雄浩，蔡巧燕，等．DPPH法測定粗疣合葉苔內(nèi)生真菌的抗氧化活性[J]．福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，20(5)：41-42．

[12]BENZIE I F F， STRAINT J J． The ferricreducing ability of plasma(FRAP)as a measure of “antioxidant power”： the FRAP assy[J]． Analytical Biochemistry，1996，239：70-76．

[13]FELL J W， BOEKHOUT T， FONSECA A， et al． Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequences analysis[J]. Int J Syst Evol Microbiol，2000，50：1351-1371．

[14]羅建軍，翁群芳，胡美英．抑菌植物的篩選及甘草對5種植物病原真菌抑菌活性的研究[J]．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33(3)：357-360．