李曉秋，周中和，徐慧琴，王耀山，陳會生

淀粉樣腦血管病26例尸檢標本免疫組化病理研究

李曉秋，周中和，徐慧琴，王耀山，陳會生

目的探討 β 淀粉樣蛋白(Aβ1-40、Aβ1-42)、β 淀粉樣蛋白前體蛋白(β-amyloid precursor protein，βAPP)以及半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C，CC)在淀粉樣腦血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)腦組織中的表達情況。方法 采用免疫組化方法，檢測26例CAA患者尸檢腦組織中Aβ1-40、Aβ1-42、βAPP和CC的表達情況。結(jié)果 Aβ1-40表達廣泛見于枕葉、顳葉、頂葉、額葉，Aβ1-42、βAPP表達可見于顳葉、枕葉和頂葉，CC表達僅見于1例頂葉和枕葉;Aβ1-40、Aβ1-42、βAPP染色陽性主要見于中、小血管的血管壁外層，CC染色陽性多見于血管壁外膜，均可見腦血管壁增厚，透明樣變性。結(jié)論 Aβ1-40是CAA血管壁內(nèi)沉積淀粉樣蛋白的主要成分，在CAA發(fā)生機制中起重要作用，并為CAA治療目標Aβ從血管的靶向清除提供指導意義。

淀粉樣腦血管病;淀粉樣蛋白;半胱氨酸蛋白酶抑制劑C;淀粉樣蛋白前體蛋白;腦出血;尸體解剖

淀粉樣腦血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)是一種顱內(nèi)微血管病變，以淀粉樣物在軟腦膜和皮層的小血管壁內(nèi)沉積為主要病理特征［1-3］。CAA目前已成為老年人原發(fā)性、非外傷性、非高血壓性腦出血的主要病因之一［4-5］，但其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，比較肯定的結(jié)果認為CAA致病基因表達的蛋白分別為β淀粉樣蛋白前體蛋白(βamyloid precursor protein，βAPP)和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C，CC)。已知超過10種不同的淀粉狀蛋白可沉積在腦血管或腦實質(zhì)［6］，最常見的為β淀粉樣蛋白(amyloidβ，Aβ)。CC是沉積在血管內(nèi)的除Aβ外的另一種淀粉樣蛋白，目前認為CC在CAA相關(guān)腦出血淀粉樣蛋白充載血管上更常見，嚴重CC沉積是CAA血腫擴大的重要危險因子。本研究采用免疫組化的方法，研究26例CAA患者尸檢腦組織的淀粉樣蛋白 Aβ1-40、Aβ1-42、βAPP、CC的表達情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 資料來源于我科1983—2013年245例腦尸解病例，逐一經(jīng)HE、剛果紅染色證實，發(fā)現(xiàn)26例CAA，男17例，女9例;年齡45～78歲，平均66.5歲。其中腦實質(zhì)出血20例，蛛網(wǎng)膜下腔出血2例，出血性腦梗死、基底節(jié)區(qū)梗死、椎基底動脈閉塞及硬膜下血腫各1例。26例均符合 Boston CAA相關(guān)腦出血(CAAH)的診斷標準［7］，出血灶周圍小血管壁剛果紅染色陽性，無其他病理改變。

1.2 方法 切片脫蠟、抗原修復，染色步驟按PV-9000通用型二步法免疫組化試劑盒說明書進行，一抗分別為淀粉樣蛋白 Aβ1-40、Aβ1-42、βAPP、CC 多克隆抗體(均購自Sigama公司)。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 光學顯微鏡觀察 以微小血管壁呈棕褐色為Aβ、CC蛋白染色陽性。每張切片在100倍光鏡下對額葉、枕葉、顳葉、頂葉、殼核、小腦、海馬4個隨機視野內(nèi)陽性微小血管進行觀察。

2 結(jié)果

26例CAA腦組織Aβ1-40的表達廣泛見于枕葉、顳葉、頂葉、額葉;Aβ1-42的表達以顳葉、頂葉、枕葉明顯，額葉及其他部位染色陰性;βAPP的表達見于顳葉、枕葉、頂葉，其他部位染色陰性;CC的表達僅見于1例CAAH患者的頂葉、枕葉，其他病例、其他部位染色均為陰性。Aβ1-40、Aβ1-42、βAPP 染色陽性主要見于中、小血管的血管壁外層，CC染色陽性多見于血管壁外膜，腦血管壁增厚，透明樣變性。4種蛋白在頂葉腦組織中的表達情況見圖1。圖1 4種蛋白在頂葉腦組織中的表達情況 A.β淀粉樣蛋白1-40表達(HE×100);B.β淀粉樣蛋白前體蛋白表達(HE×100);C.β淀粉樣蛋白1-42表達(HE×100);D.半胱氨酸蛋白酶抑制劑C表達(HE×40)

3 討論

Aβ是由βAPP經(jīng)β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而產(chǎn)生的包含39～43個氨基酸的多肽［8］。因酶切斷部位不同，Aβ的C末端可出現(xiàn)長度不同的2種分子，即 Aβ1-40、Aβ1-42［9］。Aβ 凝集性高，以 β 折疊構(gòu)造重合而形成纖維性凝集體，即β淀粉樣蛋白，是散發(fā)性、年齡相關(guān)性CAA和阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)相關(guān)性CAA以及AD老年斑中淀粉樣蛋白的主要組分。雖然Aβ1-40和Aβ1-42只有2個氨基酸的差異，但兩者的生化特性顯著不同，Aβ1-40為相對伸展的構(gòu)象:無規(guī)卷曲，而Aβ1-42主要以比較緊密的構(gòu)象:α2螺旋和β2片層構(gòu)象存在。離體實驗證實Aβ1-42較Aβ1-40有更高的纖維形成能力，而 Aβ1-40更容易聚集［10］。Aβ1-42 在淀粉樣斑塊的形成早期起重要作用，但是如果沒有Aβ1-40的繼續(xù)聚集，Aβ1-42本身無法形成成熟的、有毒性的斑塊［11］。Aβ在腦脊液中通常穩(wěn)定在800 ng/L左右，正常情況下Aβ從腦中的產(chǎn)生率和清除率分別為每小時7.6%和8.3%，清除量超過其產(chǎn)生量［12］。腦清除Aβ的機制包括:①血管途徑:Aβ與載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)、α2M等蛋白結(jié)合后，通過血腦屏障低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白介導進入血液循環(huán)系統(tǒng)，維持腦中Aβ代謝平衡。絕大多數(shù)Aβ是經(jīng)血腦屏障途徑轉(zhuǎn)運出腦。②膠質(zhì)細胞途徑:小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞均可以吞噬Aβ。③酶解途徑:目前至少有6種特殊的金屬肽酶參與Aβ的生理降解，包括胰島素降解酶(IDE)、腎胰島素殘基溶酶(NEP)、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶-1和2、金屬基質(zhì)蛋白酶-2和9、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等［13］。這些酶能將Aβ降解為無毒性的小片段［14］。在基因敲除(敲除包括NEP在內(nèi)的許多蛋白酶)小鼠實驗中可觀察到小鼠腦內(nèi)源性Aβ增加。高表達NEP和IDE的小鼠模型腦內(nèi)觀察到Aβ水平下降和Aβ斑形成減少。Aβ在腦內(nèi)沉積包括在腦實質(zhì)沉積和沿小動脈沉積，前者包括彌散性斑塊(周圍無或有輕微的神經(jīng)病理損傷)和致密的纖維狀斑塊(常伴有神經(jīng)元營養(yǎng)障礙、炎癥和神經(jīng)元纖維纏結(jié))。Aβ在細胞外沉積，即沿腦皮質(zhì)和軟腦膜的小和中等動脈以及腦微血管系統(tǒng)沉積，稱為CAA［15］。彌散性斑塊是在AD和Down＇s綜合征患者腦中最早可見到的Aβ沉積［16］，大多數(shù)發(fā)生在神經(jīng)細胞周圍，有時呈大片“云狀”，形成機制不清，可能緣于Aβ的自發(fā)性聚集，免疫組化研究表明斑塊主要由N末端縮短的非纖維化Aβ1-42組成。彌散性斑塊“成熟”后成為致密核斑塊。近來研究表明，彌散性和致密核斑塊在發(fā)生和生物化學方面均有不同，致密核斑塊通常包括神經(jīng)元營養(yǎng)障礙和炎癥，因此又被稱為“神經(jīng)炎性”或“經(jīng)典性”斑塊［17］。致密核斑塊含有較高的Aβ1-40，與血管壁內(nèi)沉積的β淀粉樣蛋白在成分和組織化學方面有相似性［18-19］。但也有研究表明，在大鼠海馬內(nèi)注射Aβ1-40可模擬AD患者的部分病理表現(xiàn)［20］。免疫組化研究表明，神經(jīng)細胞內(nèi)Aβ1-42沉積是AD患者和轉(zhuǎn)基因APP小鼠Aβ沉積的最初形式，即可出現(xiàn)在細胞外斑塊之前，也可在無細胞外斑塊存在時出現(xiàn)。而且，細胞內(nèi)Aβ與細胞外的Aβ池保持平衡，隨疾病進展Aβ可從神經(jīng)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞外(包括血管壁)［21-22］。

Obici等［23］研究發(fā)現(xiàn)導致嚴重CAA和致命性顱內(nèi)出血的Aβ變異，即Aβ選擇性在血管壁沉積，未見Aβ在腦實質(zhì)沉積和神經(jīng)元纖維纏結(jié)，其進一步遺傳分析發(fā)現(xiàn)1個新的Aβ變異，βAPP的外顯子17序列測定顯示密碼子705的第1個核苷酸從G到C易位。這一替換導致Aβ第34個殘基上的亮氨酸被纈氨酸替換，因此顯示出獨特的神經(jīng)病理學特性:Aβ選擇性定位于血管壁內(nèi)，所有切片均未見營養(yǎng)障礙性神經(jīng)炎或神經(jīng)元纖維纏結(jié)，所有患者均未攜帶與嚴重CAA相關(guān)的ε2等位基因。剛果紅染色后在偏振光顯微鏡下可觀察到特征性腦膜、大腦、小腦皮質(zhì)、小和中等大小動脈壁中Aβ沉積的蘋果綠雙折光，并可見到嚴重CAA的病理特征，如“管內(nèi)管”結(jié)構(gòu)和繼發(fā)的出血，以及繼發(fā)性微血管變性的證據(jù)，如小動脈透明變性、微動脈瘤等。應(yīng)用抗Aβ抗體進行免疫染色，提示Aβ1-40和Aβ1-42均存在。

小鼠轉(zhuǎn)基因CAA模型為我們了解腦血管淀粉樣變Aβ1-40和Aβ1-42的沉積提供了線索，轉(zhuǎn)移試驗證實Aβ具有潛在的從產(chǎn)生部位向外彌散的能力［24］。在單純分泌 Aβ1-42的小鼠模型(如倫敦APP小鼠或BRI-Aβ42小鼠)上觀察到神經(jīng)元衍生的不可溶性 Aβ1-42肽被運輸并沉積在血管壁上［25］。基于轉(zhuǎn)基因小鼠模型(如APP23和Tg2576)的研究顯示，血管淀粉樣變是自發(fā)性腦出血(腦微量出血和致命性腦葉出血)的主要原因，且Aβ在血管壁沉積可導致血管壁平滑肌細胞和其他血管壁成分變性，另外，非淀粉樣變血管也可見到超微結(jié)構(gòu)的微血管功能異常，如內(nèi)皮細胞喪失，基膜增厚和血管壁平滑肌細胞變性［26］。細胞轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)轉(zhuǎn)基因小鼠實驗結(jié)果顯示，當毛細血管基膜增厚時，加速了 CAA形成［27］，提示基膜增厚可能是CAA發(fā)展的促進因素。

Aβ1-40是Tg2576和PSAPP小鼠腦中觀察到的主要的Aβ肽，研究表明，Aβ1-40在CAA和致密核斑塊形成中起重要作用，Aβ1-40急劇減少可引起CAA和致密核斑塊形成大量減少，如APP T7141變異奧地利系譜中觀察到的，Aβ1-40體外減少約80%，腦內(nèi)幾乎未見到Aβ1-40，同時未見到CAA和致密核斑塊［28］。有研究表明，Aβ1-42 不僅對于Aβ1-40在腦實質(zhì)沉積是必需的，而且對于Aβ1-40在血管內(nèi)沉積也是必需的［25］。

本研究結(jié)果顯示，Aβ1-40、Aβ1-42和 βAPP表達廣泛見于枕葉、顳葉、頂葉、額葉腦膜及皮層，染色陽性主要見于中小血管的血管壁外層，同時可見腦實質(zhì)和腦膜血管擴張，血管壁增厚，透明樣變性。由此推測，Aβ1-40是CAA血管壁內(nèi)可沉積的淀粉樣蛋白的主要成分，在CAA發(fā)生機制中起重要作用，Aβ1-42、βAPP也可能參與了CAA的發(fā)生。

CC是冰島型遺傳性淀粉樣變腦出血(HCHWAI)中沉積在血管壁內(nèi)的除Aβ外的另一種淀粉樣蛋白，由120個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為13 260，在腦脊液中的含量是血漿中的5.5倍［29-30］。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，CAA腦出血患者腦內(nèi)淀粉樣沉積物中CC常與Aβ共存，也可以在無腦出血患者的淀粉樣變微血管壁中找到，而且CC沉積繼發(fā)于Aβ沉積。與無腦出血的CAA患者相比，CC在CAA相關(guān)腦出血(CAA-related hemorrhage，CAAH)患者淀粉樣蛋白充載血管上更常見，但其作用并不清楚，可能在腦出血的發(fā)生發(fā)展中起一定作用［31］。

目前利用Aβ和CC的單克隆抗體定位CAA已成為診斷CAA相對敏感的方法［32］。CAA患者均可顯示Aβ免疫活性，且Aβ和CC的協(xié)同定位有助于診斷CAA相關(guān)出血。散發(fā)性CAA血管壁除有Aβ沉積外，有時也可有CC沉積，但不表現(xiàn)為纖維狀結(jié)構(gòu);冰島型CAA只有CC免疫活性而無Aβ反應(yīng)。有研究顯示，嚴重CC沉積是CAA血腫增大的重要危險因子，并且在淀粉樣物質(zhì)沉積血管壁內(nèi)可見到平滑肌細胞的喪失［33］。本研究結(jié)果顯示，CC的表達僅見于1例多灶性大量腦出血，且染色陽性多位于血管壁外膜。提示CC的表達在國人散發(fā)性CAA中陽性率較低，也可能只見于CAA的亞型。

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Immunohistochem ical Study of 26 Autopsy Cases of Cerebral Amyloid Angiopathy

LIXiao-qiu，ZHOU Zhong-he，XU Hui-qin，WANG Yao-shan，CHEN Hui-sheng(Department of Neurology，General Hospital of Shenyang Military Area Command，Shenyang 110840，China)

ObjectiveTo evaluate the expressions of Aβ1-40，Aβ1-42，β-amyloid precursor protein(βAPP)and Cystatin C(CC)in the brain issues of cerebral amyloid angiopathy(CAA).MethodsExpressions of Aβ1-40，Aβ1-42，βAPP and CC in the brain samples of26 autopsy cases of CAA were detected by immunohistochemicalmethod.ResultsThe Aβ1-40 expression in vessel wallwidely existed in occipital，temporal，parietal and frontal lobes，expressions of Aβ1-42 and βAPPexisted in temporal，occipital and parietal lobes，and CC expression existed in parietal and occipital lobes of one case;positive stainings of Aβ1-40，Aβ1-42 and βAPPweremainly existed in themedium-sized and small-sized vascular outer layer of vesselwalls，positive staining of CCmainly existed in the outermembrane of the vessel walls.At the same time，thickening and hyaloid degeneration of cerebral vesselwallwere also found.ConclusionAβ1-40 is themain component of amyloid-laden vesselwalls，and it has important implications for the pathogenesis of CAA，whichmay provide therapy guidance for targeting Aβto be cleared from blood vessels.

Cerebral amyloid angiopathy;Amyloid;Cystatin C;Amyloid precursor protein;Cerebral hemorrhage;Autopsy

R743.9

A

2095-140X(2014)04-0020-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2014.04.006

遼寧省博士啟動基金(20121088)

110840沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

陳會生，E-mail:chszh@aliyun.com

2013-11-18 修回時間:2013-12-27)

·論著·