甘 藝，趙彥斌，陳福軍，孫兆增，胡仲明，劉 冰，楊煥民，曾 林

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071；3.五棵樹經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，長(zhǎng)春 130401)

比格犬ERβ419為該犬最新發(fā)現(xiàn)的ERβ剪切異構(gòu)體，尚無(wú)其生物學(xué)功能的報(bào)道。ERβ419 cDNA序列由下丘腦-垂體-性腺軸提純得到，ERβ419由1257個(gè)堿基組成，編碼419aa，命名為ERβ419。研究未知基因的生物學(xué)功能通常借助于慢病毒介導(dǎo)RNAi重組載體，本實(shí)驗(yàn)旨在篩選最有效的沉默表達(dá)載體，為后續(xù)探索比格犬ERβ419的生物學(xué)功能提供試驗(yàn)材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：

無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒、GenFectinTM基因轉(zhuǎn)染試劑、為Biomed品牌產(chǎn)品，4×SDS上樣緩沖液為Solarbio品牌產(chǎn)品，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基為Hyclone品牌產(chǎn)品，0.25%EDTA胰酶、PBS緩沖液、1 mol/L Tris-Cl、1.5 mol/L Tris-Cl為Solarbio品牌產(chǎn)品、抗MYC標(biāo)簽兔單克隆抗體(GTX115046)為GENETEX品牌產(chǎn)品，抗GAPDH兔多克隆抗體(CW0101)、HRP標(biāo)記兔二抗(CW0103)為康為品牌產(chǎn)品，DMSO為Invitrogen品牌產(chǎn)品，G418為Gibco品牌產(chǎn)品，T4 DNA Ligase和PrimeScript RT reagent Kit，SYBR?Premix Ex TaqTMII是TaKaRa品牌產(chǎn)品，胰蛋白胨、NaCl、酵母粉、脫脂奶粉等均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.1.2 菌種及細(xì)胞株：

pcDNA3.1-MYC-ERβ419重組質(zhì)粒菌液及質(zhì)粒、pGLV3/H1/GPF+Puro載體和HEK293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 穩(wěn)定表達(dá)ERβ419蛋白細(xì)胞株的構(gòu)建

1.2.1.1 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)ERβ419基因的細(xì)胞株

將細(xì)胞計(jì)數(shù)后適宜數(shù)量接種于6孔板中，高糖DMEM完全培養(yǎng)基(含有10%FBS，無(wú)雙抗)培養(yǎng)18～22 h。細(xì)胞鋪板底70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將4 μg pcDNA3.1-Myc-ERβ419重組質(zhì)粒及10 μL GenFectinTM基因轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋于50 μL 0.15 mol/L NaCl中，兩者再輕柔混合，室溫靜置5 min，混合液加入6孔板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。

將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以適當(dāng)倍數(shù)稀釋于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并設(shè)對(duì)照組細(xì)胞(同等數(shù)量的HEK293T細(xì)胞)；待細(xì)胞貼壁，并鋪至瓶底50%～70%時(shí)，加入含有青鏈霉素濃度為100 μg/ mL和G418濃度為800 μg/ mL的篩選培養(yǎng)基；每2～3日更換一次篩選培養(yǎng)基；待對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，挑取單克隆細(xì)胞至96孔板中用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；每2～3 d更換一次半濃度篩選培養(yǎng)基；篩選28 d后，可見有抗性的細(xì)胞團(tuán)未發(fā)生死亡，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，即可停藥，擴(kuò)大培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞量達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，即可檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。

1.2.1.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)目的重組真核表達(dá)載體在HEK293T 細(xì)胞中的表達(dá)

收集待測(cè)細(xì)胞于離心管，每管加入500 μL 細(xì)胞裂解液，4℃全速離心30 min；取上清，用BCA法測(cè)定上清蛋白濃度；加適量4×SDS上樣緩沖液；沸水浴10～15 min，待10%SDS-PAGE膠干后，每個(gè)膠孔加入等質(zhì)量蛋白；恒電壓電泳；蛋白膠恒電流轉(zhuǎn)印至0.45 μm PVDF膜；蛋白膜用5%脫脂奶粉封閉0.5～1 h后，按實(shí)驗(yàn)需要剪裁蛋白膜；目的蛋白膜放入抗Myc標(biāo)簽兔單抗1：1000稀釋液，GAPDH蛋白膜放入抗GAPDH兔多克隆抗體1：5000稀釋液，孵育4℃過(guò)夜；TBST洗膜3次，每次7 min；加入HRP標(biāo)記兔二抗1：3000稀釋液，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次7 min；待目的蛋白膜和GAPDH蛋白膜半干后，按原位置拼接，逐滴添加發(fā)光試劑盒A/B液等體積混合液，反應(yīng)1 min，去除混合液后，即可顯影。

1.2.2 針對(duì)ERβ419基因慢病毒介導(dǎo)RNAi重組載體的構(gòu)建

1.2.2.1 ERβ419基因shRNA序列的設(shè)計(jì)

依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，選擇ERβ419基因CDs序列為RNAi靶序列，在(網(wǎng)址http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/life-science/rnai.html)上針對(duì)每條目的基因設(shè)計(jì)出三對(duì)互補(bǔ)的siRNA模板序列，以5’-TTCAAGAGA-3’為發(fā)夾狀，每個(gè)基因設(shè)計(jì)三條特異性shRNA環(huán)形序列，并采用Blast軟件對(duì)選擇的三條靶序列進(jìn)行同源分析，排除shRNA特異性地抑制其他基因片段的可能。再在shRNA堿基序列的5‘端和3’端分別加入限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI的酶切位點(diǎn)，最后將shRNA序列插入pGLV3/H1/GPF載體中；三條shRNA的寡核苷酸，分別為：

shRNAl:5’-GATCCgctgtgatgaattacagtaTTCAAGA GAtactgtaattcatcacagcTTTTTTG-3’;shRNA2:5’-GAT CCggtcgtgtgaaggatgtaaTTCAAGAGAttacatccttcacacgacc TTTTTTG-3’;shRNA3:5’-GATCCgctcttggcaacaacttca TTCAAGAGAtgaagttgttgccaagagcTTTTTTG-3’;shNC:5’-GATCCGttctccgaacgtgtcacgtTTCAAGAGAacgtgacac gttcggagaaCTTTTTTG-3’。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒送往江蘇吉瑪生物公司合成慢病毒，病毒滴度為108。

1.2.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染病毒復(fù)數(shù)值(MOI值)的測(cè)定

將HEK293T細(xì)胞按3×103/孔細(xì)胞量接種于96孔板中；空白對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組分組鋪板后，添加無(wú)青鏈霉素的完全培養(yǎng)基至150 μL，培養(yǎng)18～22 h；取干凈1.5 mL離心管4支，分別加入90 μL新鮮完全培養(yǎng)基。向第1支離心管添加10 μL病毒原液，混勻后吸取10 μL加入第2支離心管中，以此類推，4支離心管中慢病毒濃度依次稀釋10倍，混合均勻；棄廢液，加入預(yù)混稀釋后的病毒液，空白對(duì)照組加入100 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；棄舊病毒液，加入150 μL 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h；在熒光顯微鏡下觀察侵染細(xì)胞的熒光效率，并計(jì)算慢病毒的MOI值。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)ERβ419 RNAi慢病毒重組載體的干涉效率

1.2.3.1 引物熒光定量PCR特異性設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中β-actin(AF021873)基因和比格犬ERβ剪切異構(gòu)體ERβ419編碼區(qū)序列，利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并且通過(guò)NCBI中Blast序列比對(duì)功能，初步檢測(cè)引物的特異性。引物由北京Biomed生物技術(shù)公司合成。

1.2.3.2 慢病毒侵染目的基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

按照2×105個(gè)/孔將穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞均勻鋪至細(xì)胞6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為正常培養(yǎng)組，無(wú)關(guān)序列組，shRNA1組，shRNA2組，shRNA3組。每孔加入完全培養(yǎng)基至2 mL，培養(yǎng)18～24 h；取干凈1.5 mL離心管4支，吸取1 mL新鮮完全培養(yǎng)基，加入適量病毒原液，混合均勻，棄實(shí)驗(yàn)組舊培養(yǎng)基，加入病毒稀釋液，正常培養(yǎng)基組加入同等體積的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；棄廢病毒稀釋液，加入2 mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h；根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，采用適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)方法，處理侵染慢病毒的靶細(xì)胞。

1.2.3.3 慢病毒侵染目的基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞RNA的提取

用于提取RNA的耗材、塑料器皿均經(jīng)0.1 % DEPC水浸泡24 h，高壓滅菌處理，氯仿、異丙醇及75%乙醇4℃預(yù)冷，6孔板中每孔加入1 mL Trizol，反復(fù)吹打細(xì)胞，將細(xì)胞-Trozol混合液收集用移液槍吸出，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，冰上放置5～10 min；加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩30 s，冰上放置10 min；12 000 g，4℃低溫離心15 min；將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加入0.5 mL異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，冰上放置10 min；12 000 g，4℃低溫離心15 min；棄上清，加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇，用1 mL移液器吹起沉淀；7 500 g，4℃低溫離心5 min；棄去乙醇并瞬時(shí)離心，小心吸棄并蒸發(fā)管內(nèi)液體；加入預(yù)冷的適量0.1% DEPC處理水溶解總RNA；儀器測(cè)定 A260/A280 吸光度，定量總 RNA 的濃度和純度。取1 μg RNA混合液加入0.1% DEPC 處理水配制的1%瓊脂糖凝膠槽中，150 V，10 min，檢測(cè)總RNA的完整性；根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)用0.1% DEPC 處理水稀釋 RNA。

1.2.3.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

按照PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒的說(shuō)明書在冰上配制操作。反應(yīng)條件為37 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s，所得cDNA于-20℃保存。

1.2.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)RNAi重組慢病毒載體干涉效果

按照SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)試劑的說(shuō)明書在冰上配制操作。反應(yīng)條件為預(yù)變性 95 ℃ 30 s；變性 95 ℃ 5 s，退火 58 ℃(β-actin)20 s/ 55 ℃(ERβ419)20 s，40個(gè)循環(huán)。融解曲線條件為95 ℃ 1 min；55 ℃ 1 min；55 ℃～94.6 ℃(每隔0.3℃采集一次熒光信號(hào))循環(huán)133次，每組的樣本均設(shè)3次重復(fù)；反應(yīng)結(jié)束后，軟件自動(dòng)導(dǎo)出擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線、融解曲線和循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct值)，由融解曲線判定PCR反應(yīng)的特異性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及熒光曲線的Ct值計(jì)算定量結(jié)果。使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到三條干涉序列對(duì)目的基因mRNA的抑制效果。

所有的樣品同期做三次重復(fù)，數(shù)值以x±s表示。標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)結(jié)果由IQ5儀器自動(dòng)收集、分析和導(dǎo)出。自動(dòng)顯示內(nèi)參基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、擴(kuò)增效率R2以及直線方程系數(shù)(斜率)。

1.2.3.6 Western Blot技術(shù)檢測(cè)ERβ419 RNAi重組慢病毒載體干涉效果

方法同1.2.1.2操作步驟。通過(guò)Photoshop 7.0繪圖軟件對(duì)五組實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)量差異進(jìn)行分析。每組蛋白進(jìn)行三次灰度分析，所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0處理。

2 結(jié)果

2.1 篩選ERβ419陽(yáng)性克隆細(xì)胞

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)28 d的G418篩選培養(yǎng)基的篩選，出現(xiàn)陽(yáng)性克隆細(xì)胞。挑取至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，利用半濃度G418篩選培養(yǎng)基的連續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)，狀態(tài)良好，不再死亡，即為陽(yáng)性克隆細(xì)胞。

2.2 Western Blot方法檢測(cè)ERβ419陽(yáng)性克隆細(xì)胞中表達(dá)

Western Blot結(jié)果顯示，pcDNA3.1-MYC-ERβ419(列1)編碼蛋白質(zhì)在HEK293T細(xì)胞中的的分子量大小為47×103，證明目的蛋白穩(wěn)定且高效表達(dá)(圖1)。

注：1：pcDNA3.1-MYC-ERβ419；2：HEK293T細(xì)胞。

2.3 qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)ERβ419干涉序列在mRNA水平和蛋白水平的定量分析

通過(guò)IQ5熒光定量PCR儀自帶軟件的數(shù)據(jù)和Photoshop 7.0灰度分析軟件，結(jié)合SPSS17.0分析軟件得到以下數(shù)據(jù)(表2.1)，表明，ERβ419-shNC(P> 0.05)、ERβ419-shRNA2(P> 0.05)、ERβ419-shRNA1(P< 0.01)和ERβ419-shRNA3(P< 0.01)差異極顯著，ERβ419-shRNA3的干涉效果最優(yōu)。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組目的基因mRNA和蛋白的表達(dá)情況

3 討論

ERs首先是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的生殖系統(tǒng)器官中發(fā)現(xiàn)，并研究其對(duì)機(jī)體生殖生理的影響。隨著研究方向的拓展和研究?jī)?nèi)容的深入，ERs的生物學(xué)功能已不再單純的只作用于生殖系統(tǒng)，在骨骼、中樞伸進(jìn)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等方面也有涉及，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有一定的影響。

ERs的高表達(dá)除了刺激生殖器官的發(fā)育和維持第二性征外，也可有效降低血液中的血脂含量，促進(jìn)其恢復(fù)到正常水平，促進(jìn)血管平滑肌松弛，降低血壓、保護(hù)心肌[1-2]，抑制自由基對(duì)機(jī)體傷害，直接和間接影響胰島素功能，調(diào)節(jié)血糖，有效預(yù)防阿爾茲海默病、帕金森病及骨質(zhì)疏松癥等疾病[3-7]。

但ERs的高表達(dá)對(duì)機(jī)體也有負(fù)面影響，一些生殖系統(tǒng)方面的疾病都是因此而發(fā)生的。主要發(fā)生在卵巢、子宮和胸腺等實(shí)質(zhì)器官。卵巢產(chǎn)生卵細(xì)胞和雌激素。卵巢分泌的雌激素與靶細(xì)胞上相應(yīng)受體接觸和結(jié)合，激活有絲分裂原相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)，誘導(dǎo)靶器官功能性亢進(jìn)，最終導(dǎo)致卵巢疾病的發(fā)生[8]。卵巢癌變成為了最終且最惡劣的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制與雌激素信號(hào)通路有關(guān)。子宮作為雌激素調(diào)控的靶器官之一，其內(nèi)膜細(xì)胞在妊娠期和發(fā)情周期發(fā)生周期性的增生和脫落。靶細(xì)胞受雌激素-ERs復(fù)合物的協(xié)同調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于子宮的發(fā)育及功能而言，ERs的正常表達(dá)尤為重要，但其異常激活對(duì)子宮的正常發(fā)育產(chǎn)生影響[9]。子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜腺癌、子宮肌瘤等疾病成為與ERβ相關(guān)的熱點(diǎn)子宮疾病。子宮肌瘤細(xì)胞內(nèi)ERs和E2含量均較正常肌組織高，較高含量的雌激素刺激子宮肌瘤內(nèi)的較高表達(dá)的ERs，導(dǎo)致子宮肌瘤的快速增生。乳腺組織中的血管分布密集，使不同時(shí)期分泌量不斷變化的雌激素到達(dá)間質(zhì)組織、脂肪組織及上皮細(xì)胞腺狀體等靶細(xì)胞，進(jìn)而在青春期、月經(jīng)周期和妊娠期不同生理期，完成乳腺的激素調(diào)節(jié)和生理功能。雌激素信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞增殖和凋亡等功能，乳腺癌形成則因該信號(hào)通路異常導(dǎo)致[10-12]。

RNAi因針對(duì)特定基因高效沉默其表達(dá)而通常應(yīng)用于未知基因生物學(xué)功能的研究，成為現(xiàn)今研究基因生物學(xué)功能的重要工具?？茖W(xué)家們?cè)噲D通過(guò)調(diào)節(jié)雌激素或ERs的表達(dá)而起到預(yù)防和治療疾病的效果。RNAi技術(shù)就是一種極佳的臨床治療辦法。主要是設(shè)計(jì)針對(duì)致病基因或誘導(dǎo)致病基因mRNA的干涉序列，通過(guò)特異性dsRNA的靶向作用，沉默目的基因的表達(dá)，從而抑制了疾病的發(fā)生發(fā)展。試驗(yàn)方法上便于操作，且高效持久，技術(shù)成熟。

比格犬雌性生殖系統(tǒng)方面常會(huì)出現(xiàn)繁殖能力下降、生殖器官病變等諸多問(wèn)題，其主要原因是下丘腦-腦垂體-性腺軸中雌激素正負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生異常。這種機(jī)制也受到ERs的表達(dá)量、表達(dá)水平與表達(dá)時(shí)間的調(diào)控[13-15]。ERs選擇性剪切機(jī)制產(chǎn)生的剪切異構(gòu)體增加了蛋白質(zhì)組多樣性，使雌激素信號(hào)在比格犬的生殖生理中發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用，了解ERs剪切異構(gòu)體的生理學(xué)功能成為改善該犬生殖系統(tǒng)功能異常的研究重點(diǎn)。

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