劉 侗,康馨元,任伯穎,張紅印,杜 鶴,杜 航,宋 利,張 輝,孫佳明

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

珍珠母Margaritiferaconcha為蚌科動物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)、褶紋冠蚌Cristariaplicata(Leach)或珍珠貝科動物馬氏珍珠貝Pteriamartensii(Dunker)的貝殼[1]。珍珠母是臨床上治療失眠的常用中藥,具有平肝潛陽、安神定驚、清肝明目的功效。為了進(jìn)一步明確鎮(zhèn)靜安眠作用物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題組應(yīng)用超濾技術(shù)將珍珠母超微粉總蛋白粗分離為分子量小于1 KDa的寡肽、≤10 KDa多肽、>10 KDa的蛋白，利用PCPA腹腔注射造失眠模型，考察5 min內(nèi)小鼠自主活動的次數(shù)，及其血中ATCH的含量變化，從而比較珍珠母不同分子量蛋白、多肽和寡肽對小鼠鎮(zhèn)靜安眠的作用，并初步研究其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物和試劑 珍珠母超微粉總蛋白(本課題組自制)；對氯苯丙氨酸(PCPA)，購自Sigma公司。小鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 昆明種小鼠，雄性60只，體質(zhì)量18～20 g。長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.3 儀器設(shè)備 METTLER TOLEDO電子天平(MAX=210 g，d=0.001 g)SARTORIUS AG；CR20B2型冷凍高速離心機(jī)(日本日立)；GVDV300三頻恒溫超聲波清洗器(江蘇昆山超美)；Millipore超濾儀(美國Millipore公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備 應(yīng)用超濾技術(shù)將珍珠母超微粉總蛋白粗分離為分子量小于1 KDa的寡肽、≤10 KDa的多肽、>10 KDa的蛋白。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將60只雄性小鼠隨機(jī)分6組，每組10只,分別為空白組、模型組、陽性組、寡肽組、多肽組、蛋白組。

2.3 建立模型 PCPA小鼠失眠模型的建立，按小鼠30 mg/100 g 用量腹腔注射PCPA，空白組腹腔注射相同體積的生理鹽水。腹腔注射30 h后，大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，模型成功[2]。

2.4 給藥劑量 樣品按生藥量218.75 g/kg給藥，A組、B組給同體積生理鹽水，陽性組為安定劑量(按0.04 mg/20 g)，1次/d，連續(xù)給藥7 d。

2.5 對小鼠自發(fā)活動的影響 給藥1周后，禁食12 h，將小鼠放入自主活動儀中適應(yīng)環(huán)境2 min后開始觀察并記錄5 min內(nèi)小鼠的活動次數(shù)，并記錄腦及腦干重量[3]。

2.6 樣品采集與處理 末次給藥12 h后，記錄小鼠自主活動，取小鼠眼球血，低溫2 000～3 000 r/min離心20 min，取上清，采用酶聯(lián)免疫分析方法，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)濃度。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠自發(fā)活動及臟器指數(shù)的比較 模型組小鼠的自主活動次數(shù)較其他組活動的次數(shù)多,陽性對照組、寡肽組自主活動次數(shù)與模型組比較有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而多肽組、蛋白組與模型組比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明,寡肽組對PCPA睡眠模型小鼠有助催眠作用，而其他2組無此作用。

通過對PCPA睡眠模型小鼠腦及腦干系數(shù)比較可知，藥物對小鼠腦干重量系數(shù)基本沒有影響(P>0.05),但通過觀察腦系數(shù)可知模型組與空白組比較有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PCPA藥物改變了小鼠腦重量系數(shù)，同時(shí)寡肽組、陽性組與模型比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示藥物可能對PCPA睡眠模型小鼠腦重量系數(shù)有影響，這有可能是藥物改變了PCPA睡眠模型小鼠除腦干外的其他腦組織生理指標(biāo)。見表1。

表1 各組小鼠的自發(fā)活動及臟器指數(shù)的比較

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 小鼠血清中ACTH濃度比較 采用酶聯(lián)免疫分析方法，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)濃度。以測得OD值(Y)對小鼠促腎上腺皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)物的濃度(X，ng/L)做線性回歸，得樣品ATCH含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.058 5X-0.121 5,R=0.994 5(本試劑盒性能，樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.99 0以上)。見圖1。

圖1 ACTH含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

模型組小鼠血中ACTH的含量較其他組明顯降低，給藥后失眠癥狀有明顯改善，與模型組相比，ACTH的含量都升高，其中陽性對照組與模型組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),寡肽組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),因此寡肽組對PCPA睡眠模型小鼠有催眠作用，但其他2組與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清中ACTH濃度比較

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)采用對小鼠PCPA腹腔注射的方法來造失眠模型，PCPA是5-HT的合成抑制劑，在給予足夠劑量時(shí)，它的作用可持續(xù)2周之久，除了可以降低中縫核中5-HT的濃度,還能使去甲腎上腺素、多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)的濃度降低[4]。促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)是腺垂體分泌的微量多肽激素，是腎上腺皮質(zhì)活性的主要調(diào)節(jié)者。本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫分析方法，分析血中ACTH的含量變化。結(jié)果顯示，模型組與正常組相比，血中ATCH含量顯著降低(P<0.01)。用藥后，失眠癥狀有明顯改善，小鼠在用藥5 min內(nèi)活動時(shí)間減少，并且與模型組相比血中ATCH含量顯著升高,組間均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)證明對小鼠鎮(zhèn)靜安眠作用寡肽組>蛋白組>多肽組，說明珍珠母蛋白可能是通過調(diào)節(jié)ACTH來治療失眠的。

為了進(jìn)一步明確超微粉鎮(zhèn)靜安眠作用物質(zhì)基礎(chǔ)，應(yīng)用超濾技術(shù)將超微粉總蛋白粗分離為分子量小于1 KDa的寡肽、≤10 KDa的多肽和>10 KDa的蛋白。并采用小鼠PCPA腹腔注射的方法來造失眠模型進(jìn)行測試，結(jié)果超微粉寡肽類成分(MCP)活性最強(qiáng),為鎮(zhèn)靜安眠主要活性部位，說明珍珠母寡肽類成分可能是其鎮(zhèn)靜安眠的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

[1]國家藥典委員會.中國藥典1部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

[2]Becko,Hemdahl P.On the accurate measurement of serotonin in whole blood[J].Scand J Clin Lab Invest,1998,58(6):505-510.

[3]戴俊,段金廒,李友賓,等.蘇州產(chǎn)淡水珍珠生物活性評價(jià)及鎮(zhèn)靜活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究[J].中國生化藥物雜志,2008,29(5):294-298.

[4]林杏娥.交泰丸治療失眠癥的文獻(xiàn)與實(shí)驗(yàn)研究[D].廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué),2006.