孫一寧， 孫婭楠， 王羽儂， 張景海， 馬淑驊， 王 毅△

(1沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院， 遼寧 沈陽 110016；2中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心， 北京 100700； 3北京中醫(yī)藥大學， 北京100029)

肥大細胞是免疫環(huán)節(jié)中介導過敏反應最重要的效應細胞，無論是過敏反應還是類過敏反應，其最終結果均導致肥大細胞脫顆粒，釋放細胞內活性物質產生過敏癥狀。肥大細胞的脫顆粒過程是由一系列步驟組成的,它包括囊泡的轉運、定向、錨定、融合等環(huán)節(jié)，每一個環(huán)節(jié)均受到嚴格調控，該過程可以分為脫顆粒早期和晚期2個時相，早期包括細胞內信號的傳遞，鈣離子水平的升高等階段，晚期事件主要指囊泡與細胞膜融合后，囊泡內的活性物質釋放出細胞外的過程[1-2]。

目前，實驗室判定待測物是否為過敏性物質的方法主要以大鼠嗜堿性白血病細胞(rat basophilic leukemia cells)RBL-2H3為研究對象，以檢測晚期事件為主要指標，如檢測肥大細胞釋放的活性物質β-己糖苷酶(β-hexosaminidase,β-HEX)、類胰蛋白酶、組胺等[1-4]，或用掃描及透射電鏡[5-6]觀察脫顆粒后細胞表面形貌變化，判定有無致敏物質的存在。由于技術方法的限制，對于脫顆粒早期事件與過敏性關系判定上還知之甚少。

以上傳統(tǒng)檢測方法都是時間點檢測，細胞經過各種化學固定及顯色處理，失去了活體狀態(tài)下脫顆粒的一系列生物信息，同時，很多有顏色的物質會對比色的方法帶來干擾(如大多數(shù)中藥注射劑)，引起檢測誤差和假陽性結果，而且步驟繁瑣復雜，花費較高。

在我們以前的研究工作中，構建了穩(wěn)定表達細胞表面特異性分子CD63與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)結合的CD63-GFP蛋白的RBL-2H3細胞株，對細胞內囊泡進行了可識別的熒光標記[6-7]，從而使直接觀察脫顆粒過程成為可能。在本研究中，我們基于激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy, LSCM)成像的熒光關聯(lián)譜(fluorescence correlation spectrum, FCS)技術，采用光柵圖像關聯(lián)光譜法(raster image correlation spectroscopy, RICS)，將實時動態(tài)檢測到的肥大細胞掃描圖像進一步分析計算，使圖像信息轉化為更直觀的、可直接進行比較的擴散系數(shù)，觀察熒光標記囊泡在過敏性物質刺激下的擴散系數(shù)變化，建立了新的肥大細胞脫顆粒體外檢測方法，為藥物的離體過敏物質早期快速檢測提供新的有效的方法。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、compound 48/80和β-HEX均購于Sigma；CD63-GFP轉染的RBL-2H3細胞株為本室建立并常規(guī)傳代培養(yǎng)；玻璃底黑壁96孔板(In Vitro Scientific)；玻璃底35mm培養(yǎng)皿(Shengyou Biotechnology)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；酶標儀(Bio-Rad)；激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus)；掃描電子顯微鏡(日立，S3400N)；熒光分子擴散測量軟件包(Diffusion Measurement Package,DMP)2.1 (Olympus)。

2 表達CD63-GFP的 RBL-2H3細胞的建立及培養(yǎng)

CD63-GFP質粒構建和細胞轉染按本室原有方法進行[7]。熒光標記的RBL-2H3細胞按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)于含10%熱滅活胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

3 β-己糖苷酶測定[10]

將RBL-2H3細胞以1×105cells/well接種至96孔板中培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液換為臺氏液，37 ℃孵育30 min后，加入陽性藥物compound 48/80或陰性刺激，繼續(xù)37 ℃孵育。待刺激10 min后冰浴終止反應。離心取50 μL上清液與底物β-己糖苷37 ℃行水解反應1 h，之后加入檸檬酸鈉緩沖液終止反應。離心收集反應上清液，酶標儀405 nm下檢測吸光度(Absorbance,A)。

4 掃描電鏡檢測

將RBL-2H3細胞接種至蓋玻片上培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液換為臺氏液，37 ℃孵育30 min后，加入藥物刺激，繼續(xù)37 ℃孵育。待刺激10 min后冰浴終止反應。去掉上清液后加入4%戊二醛預固定。之后經鋨酸固定、脫水、真空噴鍍等步驟后于掃描電子顯微鏡下觀察。

5 RICS觀察肥大細胞脫顆粒過程

5.1RICS原理 RICS是分析群體中一定區(qū)域內的分子運動行為的計算方法，適用于細胞體系熒光分子團的檢測。該方法能夠在保持細胞活性的前提下，測量細胞內熒光粒子的濃度和擴散系數(shù)[8]。在RICS中，激光以從左至右、由上至下逐行掃描的順序測量視野內各個位點的熒光強度，從而得到一張圖像。其中每個位點都包含了樣品的部分信息，且位點的大小與激光束的焦距無關。當熒光粒子被固定在某一點時，一段時間里在圖像范圍內發(fā)光點的熒光強度往往被淹沒在背景噪聲之中，觀測不到粒子的變化。而當一個熒光粒子在短時間內擴散到臨近的位點，在獲得的圖像上表現(xiàn)為一個位點上的熒光強度轉移到了另一個位點，2個位點間的熒光強度變化有一定的相關性，在自相關計算中能夠顯示出來。當體系中存在大量具有相同位置變化行為的熒光粒子的時候，這種空間相關性得到強化并可以進行測量，獲得熒光粒子的濃度和擴散系數(shù)信息，并進一步從擴散系數(shù)獲得粒子周邊環(huán)境和粒子體積和結構信息[9]。

RICS圖像分析分為兩步：背景減除和影像自相關計算。背景減除主要是去掉圖像中靜止的或移動緩慢的部分。由于細胞在拍攝中不會保持靜止狀態(tài)，則采取特殊的平均背景消除法[8]；背景減除之后，每張圖片都由公式(1)進行自相關計算。每張圖片自相關計算得到的數(shù)值取平均數(shù)后可套用在與擴散系數(shù)和粒子濃度呈比例關系的公式(2)中進行擬合分析計算。

(1)

(2)

I(x,y)代表每個位點上的熒光強度，ξ和Ψ分別代表x和y的變化量，〈…〉代表平均值。D指擴散系數(shù)，N指體系中的熒光粒子數(shù)，τ指時間。

以圖1為例，配制濃度為0.5 mol/L的FITC溶液，取200 μL于黑壁玻璃底96孔板。采用光子計數(shù)模式，掃描速度為12.5 μs/pixel，每張圖片大小為256×256，連續(xù)拍攝100張圖片，獲得的圖像經背景減除、自相關計算后，獲得空間自相關函數(shù)圖像。

圖1A為RICS圖像掃描的第一張,為熒光強度的偽彩圖。圖1B 為背景減除后經空間自相關計算所得圖像相關圖，其中的橫軸和縱軸分別代表水平相關位移ξ和垂直相關位移ψ。圖1C整個圖像為擬合分析結果的三維圖像，高斯峰的振幅代表擬合方程結果的大小，而高斯峰的厚度越薄，說明分子運動的速度越快。

Figure 1. Typical results for RICS calibration measurement of 0.02 g/L FITC in solution.A: raw data, the first image in the stack of images to be analyzed as displayed in RICS. The image is shown in false color, where color corresponds to intensity. Each image is 256 pixels by 256 pixels (12.8 μm by 12.8 μm). B: image correlation, the correlation peak is extended in the horizontal direction because the image is raster scanned in the horizontal direction. The horizontal axis is the horizontal correlation shift, ξ. The vertical axis is the vertical correlation shift, ψ. The color corresponds to the magnitude of the function.C: successful data fitting will result in low values for the difference between the autocorrelation and the fit. The height of the plot corresponds to the magnitude of the function. The horizontal axis is the horizontal correlation shift,ξ. The vertical axis is the vertical correlation shift, ψ. The correlation fit is the same size as the original correlation function, 64 pixels by 64 pixels.

從擬合分析的結果中我們可以得到幾個參數(shù)的數(shù)值：G(0)=(3.71±0.22)×10-5，D=(531.18±5.27) μm2/s，N=2 700.71±16.41。G(0)為公式(2)擬合分析后所得計算值，為圖像視野中分子數(shù)N的倒數(shù)；D為熒光分子的擴散系數(shù)，因此從該結果可以得出(2 700.71±16.41)個FITC分子以(531.18±5.27) μm2/s的擴散速度在溶液中做布朗運動。通過熒光分子動態(tài)測量得到G、D、N等參數(shù)，可以實現(xiàn)對視野中熒光分子運動狀態(tài)變化的定性監(jiān)測。

5.2RICS方法的應用 檢測時將特異表達熒光囊泡(CD63-GFP)的RBL-2H3細胞株進行傳代培養(yǎng)，待CD63-GFP穩(wěn)定表達后，在LSCM專用玻璃底小皿中培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液后換成1 mL臺氏液，在60倍水鏡下找到表達CD63-RBL的貼壁細胞，將視野放大至得到單個細胞的囊泡圖像，采用光子計數(shù)模式，掃描速度為12.5 μs/pixel，每張圖片大小為256×256。每組向小皿中加入10 μL不同濃度的compand 48/80。 加藥后每10 min自動掃描1次，每次連續(xù)掃描100張，共掃描至第20 min。并使用DMP軟件分析每組圖像得到擴散系數(shù)D等信息。

6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組比較采用單因素方差分析，使用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 比色法觀察compound 48/80刺激 RBL-2H3細胞釋放β-HEX的檢測

β-HEX存在于肥大細胞溶酶體中，是脫顆粒時所釋放的酶中最重要的酶，它通常伴隨組胺釋放，其釋放量與肥大細胞脫顆粒程度呈正相關，常作為肥大細胞脫顆粒的標志性檢測指標。如圖2所示，與對照組相比，compound 48/80 的3.9×10-2mg/L～2.5 mg/L劑量組均未引起β-HEX 的升高，隨著給藥濃度的升高，5 mg/L及10 mg/L劑量組可以引起β-HEX的釋放，與對照組相比有顯著差異(P<0.01)。因此，比色法檢測compound 48/80刺激β-HEX的釋放靈敏度為≥5 mg/L。

Figure 2. The release of β-HEX in RBL-2H3 cells stimulated with compound 48/80 at different concentrations.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs control.

2 掃描電鏡法觀察不同濃度compound 48/80刺激下RBL-2H3細胞的形態(tài)學變化

如圖3所示，掃描電鏡下，正常狀態(tài)下的細胞伸展狀態(tài)良好，表面皺褶飽滿，胞體可見完整板狀、斧狀偽足，隨著刺激劑的加入，細胞的形態(tài)開始改變，偽足收縮，皺褶減少，細胞表面逐漸變得光滑，并隨濃度的增高而越來越明顯，compound 48/80最低劑量組(3.9×10-2mg/L)細胞表面即可見一些較大泡狀結構，有致敏的傾向，但細胞總體形態(tài)變化不大，皺褶與偽足均較完整，從病理角度來講，該狀態(tài)就為過敏反應臨界點，但從7.8×10-2mg/L劑量組開始，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，說明從該劑量開始細胞已經開始出現(xiàn)過敏反應，開始脫顆粒。因此，掃描電鏡法檢測compound 48/80致RBL-2H3細胞脫顆粒靈敏度為≥3.9×10-2mg/L。

3 RICS法觀察不同濃度compound 48/80刺激下RBL-2H3細胞囊泡表面CD63-GFP擴散系數(shù)變化

在肥大細胞脫顆粒過程中，囊泡表面CD63分子與膜內NPC2蛋白結合[12]，傳遞脫顆粒信號，進而囊泡不斷向細胞膜移動，并最終與細胞膜融合，細胞脫顆粒，釋放囊泡內活性物質，引起過敏反應。在此過程中，由于囊泡表面CD63分子的結合狀態(tài)發(fā)生了改變，因此，必然引起該分子擴散系數(shù)的變化。由于在該細胞株中，CD63被GFP標記，因此該分子具有可識別的標識，可直接觀察。

圖4是各組細胞熒光圖像，顯得雜亂無章，不能從其中總結出脫顆粒相關規(guī)律。

Figure 3. The morphological changes of RBL-2H3 cells stimulated with compound 48/80 at different concentrations observed under scanning electron microscope (×5 000).

Figure 4. RICS measurement of degranulation of CD63-GFP-transfected RBL-2H3 cells treated with compound 48/80 at different concentrations(0～10 mg/L).Raw data of CD63-GFP-transfected RBL-2H3 cells are the first image in the stack of images to be analyzed as displayed in RICS. The image is shown in false color, where color corresponds to intensity. Each image is 256 pixels by 256 pixels (12.8 μm by 12.8 μm).

經RICS分析后，從表1中可以看出，所有給藥組(≥3.9×10-2mg/L)的擴散系數(shù)(D值)均在(3.1～3.5)×10-1μm2/s之間，與對照組[(4.02±0.10) μm2/s]相比均明顯降低(P<0.01)，熒光分子數(shù)N也顯著降低(P<0.01)。該結果與細胞脫顆粒的生理過程十分吻合。脫顆粒之初，CD63分子與NPC2蛋白結合，傳遞脫顆粒信號，分子被固定，因此D值減小；由于囊泡迅速向細胞膜方向移動，與細胞膜結合，并將胞內活性物質胞吐出細胞外，因此N值也減小。但這種減少并不是無限減少，因為細胞內的CD63分子只存在2種狀態(tài)，一種游離，一種結合，擴散系數(shù)只與這2種狀態(tài)有關，胞內CD63分子與其受體結合到達閾值后，就不會再繼續(xù)，故我們看到給藥濃度升高到1.6×10-1mg/L后，D值略有升高，并維持在(3.1～3.5)×10-1μm2/s。綜上所述，RICS法檢測compound 48/80致RBL-2H3細胞脫顆粒的靈敏度為≥3.9×10-2mg/L，與掃描電鏡方法相當。

討 論

FCS是一種利用熒光強度隨時間漲落進行分析的熒光光譜技術，早在70年代產生[13]，并逐步發(fā)展成為一種離體測量熒光分子流動性和分子間相互作用的有利工具[14-15]，其優(yōu)點在于在極小的體積里，利用了物理參數(shù)反映分子熒光的細微瞬時漲落[16-18]。其檢測優(yōu)勢不僅在于所需細胞數(shù)量少、允許實時監(jiān)測，并且可以獲得2個重要的生化物理參數(shù)：空間的平均粒子數(shù)和通過測量體積的分子的平移擴散系數(shù)[19-24]。但由于該方法的信號采集必須基于雪崩光電二極管，價格昂貴，操作復雜，限制了該技術在復雜生命科學體系里的推廣和應用。

表1 不同濃度compound 48/80刺激后RBL-2H3細胞熒光圖像經RICS分析后的輸出參數(shù)

目前測量擴散系數(shù)的方法主要以下幾種。擴散核磁共振光譜可以測量在溶液中和活體組織中分子的擴散系數(shù)[25]，所得結果準確性高、重復性好，但這種方法無法應用到細胞層面。而在細胞水平上，圖像關聯(lián)能譜法(image correlation spectroscopy, ICS)的出現(xiàn)拓展FCS所能應用的擴散時間到秒至分鐘級別，同時也可以提供熒光粒子運動的空間信息。因此，F(xiàn)CS主要應用于高時間分辨率的分子水平上的擴散運動分析，ICS主要應用于低時間分辨率的膜上蛋白質分析。而RICS的出現(xiàn)填補了兩者之間的時間分辨率的空白[26]。RICS可以在實時觀測細胞形態(tài)的同時，通過對圖片的分析計算得到細胞上特異性熒光蛋白的擴散系數(shù)和分子數(shù)。并且RICS在普通激光共聚焦設備上即可進行，操作簡便，易于推廣。

在過敏反應的過程中，肥大細胞脫顆粒[1]是其中重要的環(huán)節(jié)之一，它是引起Ⅰ型變態(tài)反應和類過敏反應的重要效應細胞。因此，肥大細胞脫顆粒的檢測是離體判定致敏性物質的主要方法。鼠嗜堿性粒細胞RBL-2H3細胞株是用于離體篩選過敏性物質的工具細胞，在過敏原存在的條件下，細胞內的囊泡向細胞膜運動，與細胞膜融合后，將囊泡內的活性物質，如組胺、β-已糖苷酶等分泌至細胞外，引起過敏反應。CD63是肥大細胞、RBL細胞的分泌囊泡膜表面標志，又被稱為溶酶體相關膜蛋白3，是包含1個溶酶體靶向域的跨膜4次的膜蛋白[10]。在受到致敏物質刺激時，CD63分子可與囊泡上的NPC2蛋白結合[11]，并參與其糖基化的過程，引起細胞脫顆粒反應。而compound 48/80是N-甲氧苯胺和甲醛的縮合物，是肥大細胞脫顆粒劑，能刺激肥大細胞產生胞吐作用，釋放組胺、類胰蛋白和少量肝素蛋白多糖等多種活性物質，常用來作為實驗性過敏反應的誘導劑[7]。本文中的陽性刺激藥物均選用compound 48/80，文中提到的靈敏度則用compound 48/80濃度表示。

本研究可以看出，與β-己糖苷酶法(5 mg/L)相比，RICS檢測法(3.9×10-2mg/L)和掃描電鏡法(3.9×10-2mg/L)靈敏度高很多。但RICS方法較掃描電鏡法簡便易行，成本低，易操作，且所觀察的指標為掃描電鏡所不能做到的活體動態(tài)觀測，能在細胞脫顆粒早期即可判定過敏反應的發(fā)生，因此其具有傳統(tǒng)方法不具備的優(yōu)勢。圖4的結果表明，單純用熒光強度成像不能獲得肥大細胞脫顆粒的任何信息，得到的圖像模糊不清，毫無規(guī)律可言，但經RICS方法計算后，可以動態(tài)地觀察到活體細胞內囊泡表面CD63分子在刺激物的作用下擴散系數(shù)的變化。該方法從原來精密、復雜、對操作人員要求較高，經商品化改進后，變得簡單易行，適合于推廣應用，因此，有潛力成為制藥企業(yè)質量控制的標準方法，或臨床過敏性物質篩查的有利工具。

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