王春華， 王蘇美， 徐 韜,2， 蘇箔金， 黃河澄， 楊惠玲△

(1中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080；2中山大學(xué)附屬佛山醫(yī)院，廣東 佛山 528000； 3中山大學(xué)附屬汕頭醫(yī)院, 廣東 汕頭 515031)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是流行于中國(guó)以及東南亞地區(qū)的一種發(fā)生于鼻咽上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，在廣東省尤為高發(fā)[1]。目前放療和順鉑同步放療是原發(fā)鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[2]，然而經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療后仍有10%～36%鼻咽癌患者出現(xiàn)鼻咽局部復(fù)發(fā)[3]。由于鼻咽癌復(fù)發(fā)的機(jī)制不清楚，鼻咽癌復(fù)發(fā)后的再治療難以取得滿意的療效[4]。之前許多文獻(xiàn)都是報(bào)道單個(gè)的腫瘤標(biāo)志物與腫瘤的作用，而鼻咽腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段的過(guò)程，所以本文采用多個(gè)腫瘤標(biāo)記物，希望能更深層次地探索其在腫瘤中的作用。在初發(fā)鼻咽癌中，Jab1是一個(gè)促瘤因素并已闡釋較為清楚[5]，但在復(fù)發(fā)鼻咽癌中的作用機(jī)制仍不清楚。Akt1在初發(fā)鼻咽癌中可以穩(wěn)定MDM2的表達(dá)，MDM2作為一種p53的負(fù)調(diào)控因子能下調(diào)p53的表達(dá)進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡[6]；而Akt1在復(fù)發(fā)鼻咽癌中機(jī)制不清。因而本實(shí)驗(yàn)研究用免疫組織化學(xué)染色方法和Western blotting方法分別檢測(cè)鼻咽癌病人組織分子標(biāo)志物的表達(dá)和鼻咽癌細(xì)胞在常態(tài)和電離輻射(ionizing radiation, IR)后蛋白表達(dá)的差異，希望能探明影響鼻咽癌復(fù)發(fā)的機(jī)制，為復(fù)發(fā)鼻咽癌預(yù)測(cè)和治療提供新標(biāo)志物與靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞 高分化人鼻咽癌 CNE1和低分化鼻咽癌細(xì)胞株 CNE-2 來(lái)自中山大學(xué)腫瘤防治中心；低分化鼻咽癌 HONE1 細(xì)胞由美國(guó)俄亥俄州立大學(xué) Ronald Glaser 教授提供;正常角質(zhì)細(xì)胞 HOK16B 由 MD 安德森癌癥中心 Jeffrey N 教授提供;鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株 CNE-2R[7]為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2取樣與病理診斷 篩查和選取中山大學(xué)附屬佛山醫(yī)院2003 年至2012 年和中山大學(xué)附屬汕頭醫(yī)院2001 年至2012 年同一鼻咽癌患者初發(fā)與復(fù)發(fā)癌組織石蠟標(biāo)本25 對(duì)和20 對(duì)，并以廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2006 年至2011 年正常人鼻咽組織石蠟標(biāo)本40 例為正常對(duì)照。病例選取的條件包括：患者放療前均未行其它治療，放療前均有明確的病理學(xué)診斷；免疫組化實(shí)驗(yàn)之前，HE 染色片請(qǐng)資深病理學(xué)教授再行確診為鼻咽癌，組織學(xué)分類明確；有完整的術(shù)后隨訪資料。所有組織標(biāo)本來(lái)源及操作均符合醫(yī)學(xué)倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.3主要試劑 Jab1 鼠單抗購(gòu)自Abcam；Akt1 兔單抗購(gòu)自Cell Signaling Technology。小鼠IgG 和兔IgG 即用型SABC 免疫組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒、Ⅰ抗稀釋液和蘇木素染液均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Western blotting Ⅱ抗為羊抗兔 IgG-HRP 和羊抗鼠IgG-HRP，均購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 所有鼻咽癌細(xì)胞用含 10% 新生牛血清、青、鏈霉素的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基；HOK16B細(xì)胞多用培養(yǎng)基為角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，使用前加入 30 mg/L bovine pituitary extract、0.2 μg/L EGF和5% FBS；細(xì)胞均置于 37 ℃、 5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2Western blotting 法檢測(cè)細(xì)胞 Jab1 和 Akt1蛋白的表達(dá) 0 Gy 和10 Gy 電離輻射(ionizing radiation,IR)照射細(xì)胞，培養(yǎng) 24 h 后收集全細(xì)胞蛋白標(biāo)本，常規(guī) BCA 方法蛋白定量。制備 15% 聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳(1.5～2 h)，轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜(60 min)，室溫 5% BSA 封閉1 h，加Ⅰ抗(Jab1，1∶500；Akt1，1∶1 000；β -actin，1∶10 000)孵育 PVDF 膜 4 ℃過(guò)夜，TBST 洗膜 3 次，加Ⅱ抗孵育 60 min，TBST 洗膜 3 次， ECL 發(fā)光液顯色曝光， ImageJ軟件分析結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參照。

2.3免疫組化 采用免疫組織化學(xué)染色 SABC(spreptavidin-biotin-peroxidase complex)法檢測(cè)Jab1 和Akt1 在初發(fā)、復(fù)發(fā)鼻咽癌中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：常規(guī)脫蠟水化，3% H2O2處理，滴加封閉液 20 min ，4 ℃條件下與Ⅰ抗(Jab1，1∶150；Akt1，1∶200)孵育過(guò)夜，次日滴加羊抗兔/羊抗小鼠 IgG，37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB) 顯色，蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline， PBS)緩沖液代替Ⅰ抗。免疫組化結(jié)果判定，高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，以胞核/漿黃染的細(xì)胞作為陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分的乘積為每個(gè)視野的分值，5 個(gè)視野的平均分值即為最終結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。4種腫瘤標(biāo)志物在初發(fā)NPC 和正常鼻咽組織表達(dá)差異采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確概率法，在復(fù)發(fā)NPC 和初發(fā)NPC 腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平差異采用符號(hào)配對(duì)秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon signed-rank test)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 復(fù)發(fā)病人 NPC 組織和初發(fā) NPC 組織Jab1 表達(dá)比較

免疫組化檢測(cè)了45 例病人配對(duì)的復(fù)發(fā)與初發(fā)鼻咽癌組織Jab1 蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性顆粒存在于胞核/胞漿中，見圖1。如表1所示，復(fù)發(fā)病人NPC 組織中，Jab1 蛋白細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)率93.02%(40/43)，細(xì)胞漿陽(yáng)性表達(dá)率為97.67%(42/43)；初發(fā)NPC 組織細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)率為95.45%(42/44)，細(xì)胞漿陽(yáng)性表達(dá)率為97.73%(43/44)。結(jié)果提示復(fù)發(fā)NPC 病人Jab1 核表達(dá)高于初發(fā)NPC 中Jab1 核表達(dá)(P<0.05) ， 兩者細(xì)胞漿之間的Jab1 表達(dá)無(wú)顯著差異。

2 復(fù)發(fā)病人 NPC 組織和初發(fā) NPC 組織Akt1表達(dá)比較

免疫組化檢測(cè)45 例病人配對(duì)的復(fù)發(fā)與初發(fā)鼻咽癌組織Akt1 蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性顆粒存在于胞核和胞漿中，見圖2A、B。結(jié)果顯示(表2)，復(fù)發(fā)NPC 組織中，Akt1 蛋白細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)率83.72 %(36/43)，細(xì)胞漿陽(yáng)性表達(dá)率為93.02 %(40/43)， 初發(fā)NPC 細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)率為74.42%(32/43)， 細(xì)胞漿陽(yáng)性表達(dá)率為81.40%(35/43)。結(jié)果提示復(fù)發(fā)NPC 病人Akt1的核表達(dá)高于初發(fā)NPC 中Akt1的核表達(dá) (P=0.01)； 兩者細(xì)胞漿之間的Akt1 表達(dá)無(wú)顯著差異。

Figure 1. The expression of Jab1 in NPC tissues (×200；×400 in the lower right). A: positive; B: negative.

表1 復(fù)發(fā)和初發(fā)NPC 組織中Jab1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)的比較

Figure 2. The expression of Akt1 in NPC tissues(×200；×400 in the lower right). A: positive; B: negative.

3 鼻咽癌細(xì)胞中Jab1 和Akt1 蛋白的表達(dá)

Western blotting法檢測(cè)CNE-1、 CNE-2、 CNE-2R 和 HONE1 鼻咽癌細(xì)胞以及 HOK16B正常角質(zhì)細(xì)胞中Jab1 和Akt1 的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示(圖3)，以正常角質(zhì)細(xì)胞HOK16B 中蛋白表達(dá)為基準(zhǔn)，輻射抗拒CNE-1、CNE-2R 和HONE1 細(xì)胞中的Jab1 蛋白表達(dá)均高于輻射敏感CNE-2 細(xì)胞中的Jab1蛋白表達(dá)(P<0.01)；輻射抗拒CNE-1、CNE-2R 和HONE-1 細(xì)胞中的Akt1 蛋白表達(dá)均高于CNE-2 細(xì)胞中的Akt1 蛋白表達(dá)(P<0.01)。 結(jié)果提示輻射抗拒鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2R 和HONE1 中Jab1 和Akt1 蛋白表達(dá)均高于輻射敏感CNE-2 中Jab1 和Akt1 蛋白表達(dá)。

4 IR 對(duì)NPC 細(xì)胞Jab1 蛋白表達(dá)的影響

Western blotting法檢測(cè)CNE-1、 CNE-2、 CNE-2R 和 HONE1 細(xì)胞接受IR照射后Jab1 蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示(圖4)，CNE-1、 CNE-2R 和 HONE1 細(xì)胞接受10 Gy IR 照射后，Jab1 蛋白表達(dá)分別顯著高于未接受IR 照射的細(xì)胞中Jab1 蛋白表達(dá)(均P<0.01)；CNE-2細(xì)胞接受10 Gy IR 照射后，Jab1 蛋白表達(dá)也顯著高于未接受IR 照射的CNE-2 細(xì)胞中Jab1 蛋白表達(dá)(P<0.01)。結(jié)果提示IR促進(jìn)CNE-1、 CNE-2、 CNE-2R 和 HONE1 細(xì)胞中的Jab1 過(guò)表達(dá)。

討 論

鼻咽癌是中國(guó)南方的高發(fā)癌癥，放療為其首選療法，雖經(jīng)過(guò)改良或與化療聯(lián)合應(yīng)用，仍有20%左右鼻咽癌患者出現(xiàn)鼻咽局部復(fù)發(fā)，且大部分接受放療的患者均呈現(xiàn)輻射抗拒，進(jìn)而加劇了NPC 的復(fù)發(fā)率。目前鼻咽癌復(fù)發(fā)機(jī)制不明了。故闡明其復(fù)發(fā)機(jī)制對(duì)于NPC 的治療至關(guān)重要。為此我們從分子標(biāo)記物角度著手，欲探討復(fù)發(fā)與初發(fā)NPC 間差異表達(dá)的分子標(biāo)記物及其與復(fù)發(fā)的相關(guān)機(jī)制。

我們通過(guò)免疫組織化學(xué)方法篩查了配對(duì)的復(fù)發(fā)與初發(fā)鼻咽癌組織中Jab1 和Akt1 蛋白的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)NPC中Jab1和Akt1核表達(dá)均高于初發(fā)NPC。為了進(jìn)一步在細(xì)胞水平中驗(yàn)證該結(jié)果，我們利用Western blotting法首先檢測(cè)同源不同輻射抗拒CNE-2R和CNE-2鼻咽癌細(xì)胞蛋白的表達(dá)差異后發(fā)現(xiàn)，Jab1和Akt1蛋白在的CNE-2R細(xì)胞中表達(dá)均高于其在CNE-2細(xì)胞中表達(dá)；再次檢測(cè)不同源不同輻射抗拒的CNE-1、HONE1 細(xì)胞與 CNE-2鼻咽癌細(xì)胞蛋白表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，Jab1 和Akt1 蛋白在CNE-1和HONE1細(xì)胞中表達(dá)均高于其在CNE-2 細(xì)胞中表達(dá)。本研究結(jié)果提示，Jab1 和Akt1 參與NPC 復(fù)發(fā)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究亦證實(shí)過(guò)表達(dá)的Jab1 促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生[8]，Wu 等[9]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Akt1 能促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生，Simioni 等[10]發(fā)現(xiàn)Akt1 在復(fù)發(fā)肝癌中的高表達(dá)且提示不良預(yù)后。我們推測(cè)Jab1 和Akt1 表達(dá)增高促進(jìn)鼻咽癌的復(fù)發(fā)。

表2 復(fù)發(fā)和初發(fā)NPC 組織中Akt1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較

Figure 3. The protein expression of Jab1 and Akt1 in CNE-1, CNE-2, CNE-2R, HONE1 and HOK16B (normal control) cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs CNE-2.

Figure 4. The protein expression of Jab1 in CNE-1, CNE-2, CNE-2R and HONE1 cells 24 h after 10 Gy of ionizing radiation (IR). Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs 0 Gy.

為了進(jìn)一步探索放療與Jab1 和Akt1表達(dá)水平的關(guān)系以及Jab1 和Akt1表達(dá)水平與鼻咽癌復(fù)發(fā)的關(guān)系，我們從細(xì)胞水平入手，比較IR 照射前后鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1、HONE1、CNE-2 與 CNE-2R，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述鼻咽癌細(xì)胞IR 照射后細(xì)胞中Jab1 的表達(dá)均高于IR 照射前的細(xì)胞。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，Akt 能通過(guò)磷酸化抑制核內(nèi)p27 作用，Jab1 能將細(xì)胞核p27 帶入細(xì)胞漿中降解，核內(nèi)p27 是一個(gè)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因素，Jab1 和Akt1 的表達(dá)水平及活性能通過(guò)調(diào)控p27 表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)室之前研究表明過(guò)表達(dá)的Jab1 通過(guò)促進(jìn)p27 核漿轉(zhuǎn)位參與NPC 輻射抗拒，干預(yù)Jab1 可逆轉(zhuǎn)NPC 輻射抗拒，也可提高輻射抗拒NPC 細(xì)胞對(duì)化療的敏感性；NPC 放化療抗拒機(jī)制可能是通過(guò)PI3K-Akt 或Jab1 通路直接作用于p27，調(diào)控p27的表達(dá)、活性及定位，影響細(xì)胞周期和凋亡[12]。由此我們推測(cè)IR 照射可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞Jab1 和Akt1 的過(guò)表達(dá)，過(guò)表達(dá)Jab1 和Akt1 通過(guò)調(diào)控下游靶蛋白介導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞輻射抗拒，進(jìn)而促進(jìn)鼻咽癌復(fù)發(fā)，而下游靶蛋白是否為p27 或其它蛋白則有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Jab1 和Akt1 能介導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞的輻射抗拒進(jìn)而促進(jìn)鼻咽癌的復(fù)發(fā)。進(jìn)一步檢測(cè)Jab1 和Akt1 介導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞輻射抗拒的下游信號(hào)通路有助于進(jìn)一步闡明鼻咽癌復(fù)發(fā)的機(jī)制，并有望為復(fù)發(fā)鼻咽癌治療提供治療靶點(diǎn)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Yu MC, Yuan JM. Epidemiology of nasopharyngeal carcinoma[J]. Semin Cancer Biol, 2002, 12(6):421-429.

[2] Lee AW, Ng WT, Chan YH, et al. The battle against nasopharyngeal cancer[J]. Radiother Oncol, 2012, 104(3):272-278.

[3] 盧泰祥, 韓 非, 李嘉欣. 復(fù)發(fā)鼻咽癌臨床研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)癌癥雜志, 2008, 18(9):661-666.

[4] Leung TW, Tung SY, Sze WK, et al. Treatment results of 1070 patients with nasopharyngeal carcinoma: an analysis of survival and failure patterns[J]. Head Neck, 2005, 27(7):555-565.

[5] Pan Y, Zhang Q, Tian L, et al. Jab1/CSN5 negatively regulates p27 and plays a role in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Res, 2012, 72(7):1890-1900.

[6] Faratian D, Goltsov A, Lebedeva G, et al. Systems biology reveals new strategies for personalizing cancer medicine and confirms the role of PTEN in resistance to trastuzumab[J]. Cancer Res, 2009, 69(16):6713-6720.

[7] 王旭丹, 楊惠玲, 郭禹標(biāo), 等. 不同輻射抗拒鼻咽癌細(xì)胞微小RNA 差異表達(dá)的研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2007, 23(6):1045-1048．

[8] Pan Y, Zhang Q, Atsaves V, et al. Suppression of Jab1/CSN5 induces radio- and chemo-sensitivity in nasopharyngeal carcinoma through changes to the DNA damage and repair pathways[J]. Oncogene, 2013, 32(22):2756-2766.

[9] Wu H, Cao Y, Weng D, et al. Effect of tumor suppressor gene PTEN on the resistance to cisplatin in human ovarian cancer cell lines and related mechanisms[J]. Cancer Lett, 2008, 271(2):260-271.

[10] Simioni C, Martelli AM, Cani A, et al. The AKT inhibitor MK-2206 is cytotoxic in hepatocarcinoma cells displaying hyperphosphorylated AKT-1 and synergizes with conventional chemotherapy[J].Oncotarget, 2013, 4(9):1496-1506.

[11] Tomoda K, Kubota Y, Kato J. Degradation of the cyclin-dependent-kinase inhibitor p27Kip1is instigated by Jab1[J]. Nature, 1999, 398(6732):160-165.

[12] Qu C, Liang Z, Huang J, et al. MiR-205 determines the radioresistance of human nasopharyngeal carcinoma by directly targeting PTEN[J]. Cell Cycle, 2012, 11(4):785-796.