張玉潔，吳 倩，廉 果

去甲斑蝥素抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的體內(nèi)外研究

張玉潔，吳 倩*，廉 果

目的 研究去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)體內(nèi)外對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用。方法 常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，24 h后隨機(jī)分為陽性對照組、空白對照組和去甲斑蝥素6個(gè)劑量組，MTT法檢測NCTD對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；建立SHG-44細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為陰性對照組、順鉑陽性對照組以及NCTD 3個(gè)劑量組，腹腔注射給藥12 d后，取血檢測血常規(guī)及肝腎功能；處死裸鼠，剝瘤稱重并計(jì)算抑瘤率。結(jié)果 NCTD 6個(gè)劑量組顯著抑制SHG-44細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間和劑量依耐性；并提高SHG-44細(xì)胞的凋亡率；NCTD 3個(gè)劑量組可抑制SHG-44細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的生長，對移植瘤裸鼠血常規(guī)及肝腎功能無明顯影響。結(jié)論 NCTD體內(nèi)外均可抑制SHG-44細(xì)胞生長，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

去甲斑蝥素；SHG-44細(xì)胞；增殖；凋亡；裸鼠

0 引言

腦膠質(zhì)瘤可導(dǎo)致患者出現(xiàn)致殘和腦功能缺失表現(xiàn)，死亡率很高。而目前臨床上對腦膠質(zhì)瘤有效的化療藥物又很少，主要以放射治療和手術(shù)治療為主[1]。斑蝥素是一種廣泛應(yīng)用于臨床的抗腫瘤中藥，但因其具有強(qiáng)烈的泌尿系統(tǒng)刺激作用而限制了其使用。將斑蝥素去除1、2位2個(gè)甲基得去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)，其藥理活性與斑蝥素相當(dāng)，但毒副作用降低[2]。NCTD是新型的抗腫瘤中藥，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性和獨(dú)特的升白細(xì)胞功能[3]，是國際上第一個(gè)有升高白細(xì)胞作用的抗癌藥物，主要用于治療肝癌、食管癌和胃癌，而其對人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)檢測了NCTD體內(nèi)外對SHG-44細(xì)胞的影響，為NCTD治療人腦膠質(zhì)瘤的臨床用藥提供了理論依據(jù)。

1 材料、試劑和儀器

人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供；SPF級BALB/C-nu裸鼠，體重16～20 g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖中心，按SPF級要求管理；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；RPMI 1640培養(yǎng)粉(Gibco公司)；順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)；ELx800型酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；流式細(xì)胞儀FACS Calibur(Becton Dickinson公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 MTT法檢測NCTD對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的抑制作用 常規(guī)培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長狀態(tài)良好時(shí)，以1×105/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中，于5% CO2、37 ℃孵箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的NCTD，使最終每組含NCTD濃度分別為：10、20、40、80、160、320 μg/mL，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)陽性對照藥順鉑組和正常細(xì)胞組，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于48、72、96 h 3個(gè)時(shí)相各取出一塊96孔板進(jìn)行MTT比色實(shí)驗(yàn)：每次于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前每孔加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，按常規(guī)采用酶標(biāo)儀(波長570 nm)測定各孔吸光度值(A)。按公式“(1-藥物孔A值/對照孔A值)×100%”計(jì)算細(xì)胞抑制率，以劑量和生長抑制率作直線相關(guān)分析。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測對細(xì)胞凋亡的影響 將SHG-44細(xì)胞以1×106/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后隨機(jī)分組，分別加入不同濃度的NCTD或陽性對照藥順鉑，對照組加入等體積的1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，常規(guī)消化洗滌細(xì)胞后，用70%預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞，置4 ℃環(huán)境待測凋亡率。檢測前，先離心棄上清，再用PBS洗滌后置于檸檬酸緩沖液中1 h以上，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL左右，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.3 體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn) 裸鼠皮下移植瘤模型的建立：將約1×107個(gè)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于BALB/C-nu裸鼠右腋皮下，致瘤后，無菌條件下以組織塊移植傳代，4代后生物學(xué)特征穩(wěn)定。以無菌技術(shù)取出皮下移植瘤，剪切后，按2 mm3/鼠用套管針接種于裸鼠右腋皮下，待腫瘤生長至約100 mm3時(shí)，將荷瘤鼠隨機(jī)分為5組：正常組、順鉑(20 mg/kg)陽性對照組、NCTD(25、50、100 mg/kg)3個(gè)劑量組，每組10只。正常組每日給生理鹽水灌胃，順鉑和NCTD組采用腹腔注射方式給藥，每次0.2 mL，皆連續(xù)給藥12 d。

2.3.1 體重、血常規(guī)及肝、腎功能的檢測 末次給藥后24 h，對裸鼠行體重稱量后，每只腹腔注射0.5%肝素0.5 mL，使之肝素化，5～6 min后摘除眼球取血，一部分肝素抗凝全血用以檢測血常規(guī)中白細(xì)胞(leukocyte，Leu)、血紅蛋白(haemoglobin，Hb)和血小板(platalet，Plt)的濃度；另一部分離心分離出血漿，用以檢測肝功能中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase，γ-GT)和腎功能中血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)的濃度。

2.3.2 抑瘤率的檢測 取血后，頸椎脫臼處死裸鼠，立即完整剝離瘤塊，稱量瘤塊重量，計(jì)算各組平均瘤塊重量及抑瘤率。抑瘤率(%)=[1-(給藥組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)]×100%。

3 結(jié)果

3.1 NCTD對SHG-44細(xì)胞生長的抑制作用 置顯微鏡下觀察，NCTD作用后的細(xì)胞排列稀疏，隨作用時(shí)間延長和藥物濃度的增加細(xì)胞密度逐漸減少。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各劑量組NCTD對SHG-44細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長，抑制率增加，NCTD對SHG-44細(xì)胞的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 NCTD對SHG-44細(xì)胞增殖的抑制作用

3.2 NCTD對SHG-44細(xì)胞凋亡的影響 各濃度NCTD作用于SHG-44細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，且隨著劑量的增加，細(xì)胞凋亡率明顯增加，并出現(xiàn)凋亡典型性特征峰。見表1。

表1 NCTD對SHG-44細(xì)胞凋亡的影響

注：與細(xì)胞對照組比較，*P<0.001

3.3 NCTD對荷瘤裸鼠血常規(guī)、肝腎功能和體重的影響 腹腔注射給藥12 d后，陽性對照組荷瘤裸鼠的白細(xì)胞數(shù)為(8.1±1.8)×109/L，明顯低于陰性對照組(11.7±2.3)×109/L(P<0.05)；而NCTD 3個(gè)給藥組血常規(guī)、肝腎功能以及體重的檢測結(jié)果與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 荷瘤裸鼠的血常規(guī)、肝腎功能和體重檢測結(jié)果

注：與陰性對照組比較，*P<0.05

3.4 NCTD對荷瘤裸鼠異種移植瘤生長的抑制作用 腹腔注射NCTD 12 d后，處死各組裸鼠，取瘤塊稱重的結(jié)果顯示，高、中、低3個(gè)劑量組瘤塊重量均明顯低于陰性對照組(P<0.05或P<0.001)，抑瘤率分別為50.40%、34.86%和19.71%，呈現(xiàn)劑量依賴性，提示NCTD對SHG-44細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，結(jié)果見表3。

表3 給藥12 d后各組瘤塊質(zhì)量及抑瘤率比較

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最為常見的原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的44%。膠質(zhì)瘤多浸潤性生長，手術(shù)很難將顱內(nèi)侵襲灶完全切除。目前多采用手術(shù)、化學(xué)治療或放射治療聯(lián)合治療，最大限度殺傷腫瘤細(xì)胞是膠質(zhì)瘤綜合治療中的重要環(huán)節(jié)[4-9]。多數(shù)膠質(zhì)瘤對放射線不敏感，化療藥物又難以透過血腦屏障，目前尚缺乏滿意的治療手段，因此，如何有效地控制甚至治愈膠質(zhì)瘤仍是亟待解決的難題。去甲斑蝥素不僅具有顯著的抗癌作用，且毒性作用較小，同時(shí)具有上調(diào)白細(xì)胞、保護(hù)肝細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫功能等作用，在抗腫瘤方面有著不容忽視的作用。

抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡是腫瘤防治的關(guān)鍵手段之一。細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡(Programmed cell death)，是生物體為了除去多余、損傷或感染的細(xì)胞而進(jìn)行的主動(dòng)自殺行為[10]。凋亡不僅直接影響著機(jī)體組織的正常發(fā)育、分化與死亡，其在腫瘤治療中的作用也已受到極大的重視[11-12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，NCTD能夠有效地殺傷SHG-44細(xì)胞，抑制其增殖，細(xì)胞抑制率呈濃度、時(shí)間依賴性，且顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，NCTD還可誘導(dǎo)SHG-44細(xì)胞凋亡，且隨著濃度的增大，細(xì)胞凋亡率增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明NCTD可通過誘導(dǎo)SHG-44細(xì)胞凋亡而抑制其增殖。裸鼠異種移植瘤模型是人們進(jìn)行腫瘤實(shí)驗(yàn)性治療廣泛采用的研究手段，人體內(nèi)腫瘤與人腫瘤細(xì)胞裸鼠異種移植瘤對藥物反應(yīng)的一致性已獲得證實(shí)[13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對建立的SHG-44細(xì)胞裸鼠異種移植瘤行腹腔注射方式給藥12 d后，高、中、低3個(gè)劑量組的NCTD抑瘤率分別達(dá)到50.40%、34.86%和19.71%，提示NCTD具有明顯的體內(nèi)抗人腦膠質(zhì)瘤活性，且作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

藥物濃度超過一定范圍會(huì)帶來毒副作用，通常表現(xiàn)在對胃腸道、造血系統(tǒng)及肝腎功能的影響上。本研究在給藥12 d內(nèi)觀察移植瘤裸鼠一般狀況，高、中、低3個(gè)劑量NCTD給藥組均未見裸鼠有消瘦、厭食、活躍程度下降等明顯異常；給藥12 d后的血常規(guī)和肝腎功能檢測結(jié)果顯示，3個(gè)濃度NCTD給藥組和陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在本研究的給藥劑量下，NCTD對SHG-44細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，而對裸鼠正常血細(xì)胞和肝、腎器官無明顯毒副作用。相比之下，陽性對照組荷瘤裸鼠的白細(xì)胞數(shù)明顯低于陰性對照組，推測與順鉑具有一定的骨髓抑制性有關(guān)。

腫瘤的形成和發(fā)展是極其復(fù)雜的過程，涉及多個(gè)細(xì)胞因子及凋亡通路，在治療后期僅依靠去甲斑蝥素抑制惡性膠質(zhì)瘤難以取得有效的成果，若將其與其他化療藥聯(lián)合應(yīng)用，能否有效控制腫瘤生長，減少耐藥性，值得進(jìn)一步研究。

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Inhibition effect on human gliomas cell of norcantharidininvivoandinvitro

ZHANG Yu-jie,WU Qian*,LIAN Guo

(Xiangyang Central Hospital,Xiangyang 441021,China)

Objective To study the inhibition effect on human gliomas of norcantharidin (NCTD)invivoandinvitro.Methods Cells were cultivatedinvitro,and then were divided into positive control group,negative control group and NCTD six doses groups randomly after being cultured for 24 h.The cytostatic effect of NCTD on human gliomas was evaluated by MTT assay.Flow cytometry was utilized for measuring the apoptosis.The nude mice with SHG-44 cell xenografts were treated with drugs via intraperitoneal injection daily,and were divided into 5 groups:negative control group,positive control group,NCTD three doses groups.After 12-day treatment,blood routine,liver and kidney function were detected.Results NCTD inhibited cell growth in a concentration and time-dependent manner.And the apoptosis rates were elevated.NCTD remarkably inhibited the growth of SHG-44 cell xenografts,no significant effect was found on nude mice blood,liver and kidney function.Conclusion NCTD can inhibit the growth of SHG-44invitroandinvivo,and induce SHG-44 apoptosis.

NCTD;SHG-44;Proliferation;Apoptosis;Nude mice

2013-06-26

湖北襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441021

*通信作者