王 智，郅克謙，許志鵬，張瑞智

·論著·

三七總皂苷對大鼠腹部游離皮瓣存活的影響

王 智1a，郅克謙1b*，許志鵬2，張瑞智3

目的 觀察三七總皂苷對大鼠腹部游離皮瓣氧化應(yīng)激、血液流變學(xué)以及皮瓣存活率的影響，初步探討三七總皂苷影響皮瓣存活的可能機(jī)制。方法 健康清潔雄性SD大鼠144只，隨機(jī)平均分為假手術(shù)組(SO組)，缺血再灌注組(IR組)和三七總皂苷干預(yù)組(PNS組)。建立大鼠右下腹部游離皮瓣模型。在術(shù)前30 min分別給予生理鹽水(SO組、IR組)、三七總皂苷注射液(PNS組)腹腔注射，一次性給藥。術(shù)后檢測各組大鼠血液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及血液流變學(xué)指標(biāo)，并觀察皮瓣成活率。結(jié)果 IR組、PNS組于皮瓣組織再灌注后(即血管吻合成功后)4、8、24 h 3個時點(diǎn)，MDA含量均高于SO組，SOD活性及血液流變學(xué)指標(biāo)則低于SO組(P<0.05)；同時，PNS組在這3個時點(diǎn)的各項(xiàng)指標(biāo)又優(yōu)于IR組(P<0.05)。皮瓣成活率為：缺血再灌注組<三七總皂苷組<假手術(shù)組(P<0.01)。結(jié)論 三七總皂苷能通過改善微循環(huán)和提高機(jī)體抗氧化的能力，促進(jìn)皮瓣成活。

游離皮瓣；氧化應(yīng)激；血液流變學(xué)；三七總皂苷

0 引言

在整形和顯微外科等領(lǐng)域，由于游離皮瓣能夠較大距離轉(zhuǎn)移，修復(fù)面積較大，因此，經(jīng)常被應(yīng)用于腫瘤切除、創(chuàng)傷、慢性潰瘍或其他疾病造成的軟組織缺損的修復(fù)重建中，以達(dá)到創(chuàng)面修復(fù)、功能重建及形態(tài)恢復(fù)的目的。但在游離皮瓣遠(yuǎn)位移植后，各種原因引起的皮瓣部分或全部壞死嚴(yán)重影響了組織缺損區(qū)外觀的改善和功能重建?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，移植后的皮瓣血供單一、側(cè)支循環(huán)缺乏造成的局部組織缺血、缺氧，血液循環(huán)障礙尤其是微循環(huán)障礙導(dǎo)致皮瓣的局部缺血、瘀血、血栓形成等是導(dǎo)致皮瓣部分或全部壞死的始動因素[1]。值得關(guān)注的是近年來研究表明，皮瓣缺血、缺氧造成的局部組織內(nèi)環(huán)境紊亂、氧自由基所致的脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)鈣超載，也是影響皮瓣成活的重要因素[2]。因此，如果能在游離皮瓣移植后，利用某些影響因素減輕微循環(huán)障礙和缺血再灌注損傷，防止皮瓣壞死和提高移植成活率，將對臨床改善皮瓣修復(fù)術(shù)后患者的預(yù)后有著極為重要的意義。

三七總皂苷(Panax notoginseng saponins，PNS)具有多種生物學(xué)活性和藥理作用，相關(guān)研究表明其能清除自由基，防止脂質(zhì)過氧化損傷，松弛血管平滑肌而緩解微動脈痙攣、降低微小血管阻力、減輕血管內(nèi)皮損傷；抑制血小板聚集、抗凝血、改善血液流變學(xué)特征[3]。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠腹部游離皮瓣模型，觀察不同時段各組皮瓣的血液流變學(xué)、生化指標(biāo)的變化，探討三七總皂苷對游離皮瓣成活的影響及作用機(jī)制，為臨床防治皮瓣壞死提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選用雄性清潔級SD大鼠144只，鼠齡80 d左右，體重(340±20) g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。術(shù)前在恒濕恒溫環(huán)境下飼養(yǎng)1周，手術(shù)前12 h禁飲食。注射用三七總皂苷(購自昆明興中制藥有限責(zé)任公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(購自上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司)，北京中勤世帝LG-R-80A血液黏度儀(由本院檢驗(yàn)科提供)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 144只大鼠隨機(jī)平均分為假手術(shù)組(SO組)，缺血再灌注組(IR組)和三七總皂苷干預(yù)組(PNS組)，每組48只。其中，每組隨機(jī)選取8只大鼠用于檢測皮瓣成活率，剩余40只大鼠再按皮瓣組織取材的5個相應(yīng)時間點(diǎn)即切斷股動靜脈前、再灌注前(即血管吻合成功前)、再灌注后(即血管吻合成功后)4、8、24 h分成5個亞組(分別計(jì)為T1～5)，每組8只。

1.2.2 模型制備 參照Ozkan[4]方法，在各組大鼠右下腹部設(shè)計(jì)一塊大小為4.0 cm×3.0 cm游離皮瓣(皮瓣的蒂部靠近腹股溝)，此皮瓣的血供主要由股動、靜脈分支的腹壁淺動、靜脈供應(yīng)。消毒后沿設(shè)計(jì)線切至腹外斜肌肌膜淺層，自頭端向尾端鈍性分離皮瓣，分離出股動、靜脈主干及腹壁淺動、靜脈，結(jié)扎并剪斷股動、靜脈遠(yuǎn)端，保留接連皮瓣的腹壁淺動、靜脈作為蒂部相連，以保證其為惟一的血供。SO組：游離皮瓣制備完成后原位縫合，不做任何處理；IR、PNS組：仔細(xì)分離近心端股動靜脈；于股動靜脈發(fā)出腹壁淺動、靜脈處上方1.0 cm左右上微血管夾并切斷股動、靜脈，兩斷端先后用肝素、利多卡因、生理鹽水沖洗后，在外科顯微鏡下以11/0無創(chuàng)縫合線依次吻合股靜脈及股動脈，松開微血管夾，確認(rèn)腹壁淺血管血流恢復(fù)、皮瓣顏色逐步紅潤為血管吻合成功(吻合時間不超過2 h)，最后原位縫合皮瓣。

1.2.3 給藥方法 術(shù)前30 min，SO組和IR組腹腔注射生理鹽水4 mL/kg，PNS組分別腹腔注射三七總皂苷40 mg/kg，注射點(diǎn)避開皮瓣，給藥位置達(dá)皮瓣正下方。

1.2.4 取材和處理 各實(shí)驗(yàn)組所分亞組內(nèi)的共120只大鼠按如前所述T1～55個相應(yīng)時間點(diǎn)，分別于皮瓣近蒂處取成活的全層皮瓣組織一塊，大小約1.0 cm×0.5 cm×0.2 cm，于-85 ℃冰箱留存待做生化檢測。各亞組大鼠在完成皮瓣組織取材同時，從股動脈中抽全血5 mL，置于肝素鈉抗凝管，立即進(jìn)行血液流變學(xué)檢測。

1.2.5 觀察指標(biāo) (1)皮瓣成活率：術(shù)后第7 d觀察三組先前確定的24只大鼠腹部皮瓣情況，以皮瓣呈粉紅色，觸之柔軟，彈性較好認(rèn)為成活；以皮瓣失去彈性，大部分呈灰黑色結(jié)痂認(rèn)為壞死。用數(shù)碼相機(jī)對24只大鼠皮瓣拍照后，采用Leica Q 550 CW計(jì)算機(jī)圖像信號采集與分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析并計(jì)算皮瓣成活率。皮瓣成活率(%)=皮瓣成活面積/皮瓣總面積×100%。(2)生化指標(biāo)：將冰凍保存的皮瓣組織標(biāo)本(共120組)勻漿，離心后取上清液，按照丙二醛檢測試劑盒、超氧化物歧化酶檢測試劑盒說明書檢測。(3)血液流變學(xué)：各亞組大鼠抽得的血液標(biāo)本(共120組)置于北京中勤世帝LG-R-80A血液黏度儀上，立即檢測全血高切、中切、低切黏度、血漿黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)等指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 皮瓣成活率 SO組：大鼠皮瓣全部成活：皮瓣?duì)顟B(tài)與周圍皮膚組織相同，顏色紅潤，彈性良好，未見水腫。IR組：較多數(shù)量皮瓣出現(xiàn)壞死：顏色呈黑色或灰黑色，質(zhì)地變硬失去彈性，有痂殼形成；個別局部有潰爛或滲出，部分皮瓣下方有血腫形成。PNS組：皮瓣存活情況與SO組相似，少量皮瓣雖出現(xiàn)壞死，但壞死面積明顯小于IR組；部分皮瓣僅表現(xiàn)為在遠(yuǎn)端顏色較為發(fā)暗，彈性稍差，毛發(fā)再生不良，或可見散在結(jié)痂創(chuàng)面，其下有少量滲出液，無明顯水腫、血腫。

皮瓣成活率：如表1所示，與SO組相比，IR組大鼠皮瓣成活率明顯較低，統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異(P<0.01)；PNS組皮瓣成活率較SO組為低(P<0.01)，而與IR組相比，PNS組大鼠皮瓣成活率明顯較高，存在顯著性差異(P<0.01)。

表1 術(shù)后7 d三組大鼠皮瓣成活率比較

注：與SO組相比，*P<0.01；與IR組相比，**P<0.01

2.2 生化指標(biāo) (1)MDA:SO組在5個時點(diǎn)皮瓣組織中的MDA值均保持在較低水平，而IR組和PNS組只在T1和T2時點(diǎn)(即再灌注前)的MDA值保持較低水平，與SO組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IR組和PNS組在皮瓣組織再灌注以后(即血管吻合成功后)的T3～5時點(diǎn)MDA值逐漸升高，與SO組在同一時點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P<0.05)；PNS組MDA值升高的幅度不如IR組明顯，與IR組在同一時點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。(2)SOD：SO組在5個時點(diǎn)皮瓣組織中的SOD活力均保持在較高水平，而IR組和PNS組只在T1和T2時點(diǎn)的SOD活力保持較高水平，與SO組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IR組和PNS組在再灌注以后的T3～5時點(diǎn)，SOD活力逐漸降低，與SO組在同一時點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PNS組SOD活力降低的幅度不如IR組明顯，與IR組在同一時點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 三組大鼠皮瓣不同時間點(diǎn)MDA含量的比較

注：與SO組相比，*P<0.05；與IR組相比，**P<0.05

表3 三組大鼠皮瓣不同時間點(diǎn)SOD活力的比較

注：與SO組相比，*P<0.05；與IR組相比，**P<0.05

2.3 血液流變學(xué) SO組大鼠在5個時點(diǎn)血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)基本沒有變化，而IR組和PNS組只在T1和T2時點(diǎn)各項(xiàng)指標(biāo)值與SO組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在再灌注以后的T3～5時點(diǎn)各指標(biāo)值明顯升高，與SO組在同一時點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PNS組各指標(biāo)值升高的幅度不如IR組明顯，與IR組在同一時點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

小血管吻合游離皮瓣移植手術(shù)的開展，使病灶部位大面積缺損后施行立即修復(fù)成為可能。但吻合血管的游離皮瓣是缺血性組織，在從血管離斷到吻合完成之后血管再通，會人為地造成微血管循環(huán)障礙和缺血再灌注損傷。其中包括皮瓣的缺血與血管痙攣、白細(xì)胞介導(dǎo)的感染、血小板聚集及內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起的血栓形成和氧自由基的釋放導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷等[5]。而血液供應(yīng)量減少及靜脈回流障礙是導(dǎo)致皮瓣缺血壞死和缺血再灌注損傷主要原因，血液循環(huán)的重建是皮瓣成活的基礎(chǔ)[6]，因此，改善皮瓣微循環(huán)、增加皮瓣的血運(yùn)、防止皮瓣的再灌注損傷是提高皮瓣成活率的努力方向。本研究建立了大鼠腹部游離皮瓣模型，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上選取了特定5個時間點(diǎn)進(jìn)行分組，其中T1(切斷股動靜脈前)可以認(rèn)為相當(dāng)于臨床手術(shù)過程中游離皮瓣斷蒂前、T2(血管吻合成功即刻)則可以認(rèn)為相當(dāng)于臨床手術(shù)過程中皮瓣血管吻合后組織再灌注即將開始，T3～5可認(rèn)為是游離皮瓣發(fā)生缺血再灌注損傷的階段，在這5個時間點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)本取材，可以動態(tài)觀察皮瓣的病理生理變化，以期更好地將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床實(shí)際結(jié)合起來分析。

表4 三組大鼠不同時間點(diǎn)血液流變學(xué)指標(biāo)的比較

注：與SO組相比，*P<0.05；與IR組相比，**P<0.05

既往研究已證實(shí)三七總皂苷能改善血液流變學(xué),抑制血小板及紅細(xì)胞聚集,降低血液黏稠度,擴(kuò)張微細(xì)血管,改善微循環(huán),對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，以防止生物膜損傷及鈣超載引起細(xì)胞損傷[7-9]。三七總皂苷對氧自由基有清除作用，在組織缺血再灌注損傷后，能顯著減少缺血區(qū)組織的脂質(zhì)過氧化物MDA，提高SOD活性，并能預(yù)防性對抗過氧化氫和超氧陰離子引起的氧化性損傷，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)對缺血、缺氧組織的損害，因此，對缺血的皮瓣組織具有保護(hù)作用[10]。

組織缺血過程中氧自由基產(chǎn)生過多或抗氧化系統(tǒng)活性下降,可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷細(xì)胞膜，使細(xì)胞受損[11]。氧自由基與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA，能反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平，其含量可間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度[12]。SOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它可對抗與阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的對細(xì)胞傷害。此酶能清除超氧陰離子自由基(O·)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，SOD活力的高低可間接反映機(jī)體清除自由基的能力[13]。本研究結(jié)果顯示，皮瓣缺血再灌注后IR組MDA含量隨時間延長逐漸增高，SOD的活性逐漸降低，說明氧自由基在皮瓣內(nèi)蓄積，并導(dǎo)致膜脂質(zhì)的過氧化和SOD的消耗。而在腹腔注射三七總皂苷后，PNS組MDA含量較IR組降低而SOD的活性明顯提高，說明三七總皂苷具有清除氧自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷的作用。與生化檢測結(jié)果類似，缺血再灌注后，IR組血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)值隨時間延長逐漸增高，說明皮瓣組織血管內(nèi)血液黏度增加、血細(xì)胞聚集，從而導(dǎo)致微循環(huán)、微血管血流減緩或停滯，有加重微循環(huán)障礙的趨勢；而在腹腔注射了三七總皂苷的PNS組，其各項(xiàng)指標(biāo)值隨時間延長雖然也逐漸增高，但升高的幅度明顯低于IR組，說明三七總皂苷具有調(diào)整血液流變學(xué)異常、降低血流阻力、減少血栓形成風(fēng)險的作用。從最終三組大鼠皮瓣成活率的結(jié)果上來看，三七總皂苷干預(yù)組的皮瓣成活率明顯比缺血再灌注組要高，因此，可以推測三七總皂苷可能通過改善微循環(huán)，減輕氧化損傷導(dǎo)致的再灌注損傷，促進(jìn)皮瓣移植后的成活。但由于皮瓣缺血、缺氧性損傷的機(jī)制比較復(fù)雜，目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚不能排除其他可能的保護(hù)機(jī)制，需要進(jìn)一步深入研究三七總皂苷對組織中抗氧化能力和血液流變性是如何發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的。綜上所述，三七總皂苷對大鼠移植后的游離皮瓣具有保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用于提高皮瓣存活率提供了一定的理論依據(jù)。

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Effects of panax notoginseng saponins on survival of free abdominal skin flap in rats

WANG Zhi1a,ZHI Ke-qian1b*,XU Zhi-peng2,ZHANG Rui-zhi3

(1a.Department of Anesthesiology,1b.Department of Oncological Head and Neck Surgery,Stomatology Hospital of Xi′an Jiaotong University,College of Medicine,Xi′an 710004,China;2 Department of Stomatology ，The People′s Hospital of Shanxi Province,Xi′an 710068,China;3.Department of Stomatology,Ankang Central Hospital,Ankang 725000,China)

Objective To investigate the effects of panax notoginseng saponins (PNS) on hemorrheology and oxidative stress in rats，and to explore the protective effects and mechanism of PNS on survival of free abdominal skin flap.Methods 144 male SD rats were classified into sham operation group (SO group),ischemia/reperfusion group (IR group) and PNS intervening group (PNS group) at random.To establish the models of free skin flap in rat right abdomen.30 min before surgery,rats were intraperitoneal injected PNS for PNS group and saline for SO and IR group.The level of malonyldialdehyde (MDA) and the superoxide dismutase (SOD) activity were compared between these groups,and the survival rate of flap was observed using image analysis.Results The expression of MDA in IR and PNS group was higher than that in the SO group at 4,8,24 hours after reperfusion,especially in the IR group (P<0.05).The activity of SOD and hemorrheology in IR and PNS group was lower than that in the SO group at 4,8,24 hours after reperfusion,especially in the IR group (P<0.05).The survival rate of flap was:IR group

Free skin flap；Oxidative stress；Hemorrheology；Panax notoginseng saponins

2013-12-26

1.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院a.麻醉科，b.頭頸腫瘤外科，西安710004；2陜西省人民醫(yī)院口腔科，西安710068；3安康市中心醫(yī)院口腔科，安康 725000

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272957)；西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目(SF1023)

*通信作者