田筱青，孫丹鳳，房靜遠(yuǎn)

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化科，上海市消化疾病研究所，上海 200001)

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶M1(glutathione-s-transferase, GSTM1)是Ⅱ相代謝酶GST家族重要成員，催化其活性基團(tuán)谷胱甘肽與前致癌物結(jié)合，增加后者水溶性，促進(jìn)其排出體外。GSTM1具有(+/+)、(+/-)、(-/-)3種基因型，前兩種基因型為非空白基因型，而(-/-)基因型又稱為空白基因型?？瞻谆蛐鸵?yàn)榛蚣兒先笔?，故無(wú)相應(yīng)的蛋白酶活性，不能對(duì)致癌物質(zhì)進(jìn)行有效代謝清除，導(dǎo)致有害物質(zhì)體內(nèi)蓄積，損傷細(xì)胞和遺傳物質(zhì)，從而增加腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性。GSTM1基因啟動(dòng)子甲基化是調(diào)控該基因表達(dá)的表觀遺傳方式。本研究檢測(cè)6種結(jié)腸癌細(xì)胞系中GSTM1基因型、甲基化狀態(tài)、轉(zhuǎn)錄水平及去甲基化藥物對(duì)GSTM1基因轉(zhuǎn)錄的影響，探討GSTM1基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的遺傳和表觀遺傳狀況及對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)HT29、HCT116、SW480、SW1116、Lovo、colo結(jié)腸癌細(xì)胞系為上海市消化疾病研究所保存。在37 ℃、50 mL/L CO2的條件下，HT29和HCT116培養(yǎng)于MaCOY’s 5A中，SW480、SW1116、Lovo、colo培養(yǎng)于RPMI 1640中。去甲基化藥物5-aza-dC(Sigma公司)終濃度5 μmol/L處理結(jié)腸癌細(xì)胞系72 h，等體積的DMSO處理細(xì)胞作為溶劑對(duì)照。

1.2DNA提取及多重PCR檢測(cè)提取結(jié)腸癌細(xì)胞系基因組DNA，紫外分光度計(jì)檢測(cè)DNA含量和純度(A260/A280>1.8)。以結(jié)腸癌細(xì)胞系DNA為模板，行多重PCR檢測(cè)，GSTM1擴(kuò)增產(chǎn)物273 bp，引物序列為5′-CTGCCCTACTTGATTGATGGG-3′，5′-CTGGATTGTAGCAGATCATGC-3′，同時(shí)擴(kuò)增interferonb為內(nèi)參照，擴(kuò)增產(chǎn)物170 bp，引物為5′-GGCACAACAGGTAGTAGGCG-3′，5′-GCCACA-

GGAGCTTCTGACAC-3′。PCR反應(yīng)總體積20 μL，模板DNA 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTP混合物1 μL，Taq酶1 U。94 ℃變性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃延伸10 min。雙蒸水代替DNA進(jìn)行PCR作陰性對(duì)照。20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳。

1.3甲基化特異PCR(MSP)檢測(cè)重硫酸氫鹽修飾：取DNA約1 μg，加入終濃度0.3 mol/L的NaOH中，37 ℃水浴30 min；3.9 mol/L亞硫酸氫鈉 (pH 5.0)520 μL與10 mmol/L對(duì)苯二酚30 μL混合，加入堿變性后的DNA 50 μL，覆蓋礦物油，55 ℃水浴18 h。

模板DNA純化：經(jīng)過(guò)堿基修飾的DNA用Wizard DNA純化試劑盒純化。0.3 mol/L NaOH與純化DNA反應(yīng)去除硫化基團(tuán)，乙酸鈉、乙醇沉淀DNA，去離子水重懸，-20 ℃保存。

PCR擴(kuò)增：采用GSTM1基因特異的甲基化引物(5′- GAAGTTGGCGAGGTCGAGTTTC-3′，5′-ACCCGCCACAACCCGAAAAACG-3′)和非甲基化引物(5′-GGGAAGTTGGTGAGGTTGAGTTTT-3′，5′-CAACCCACCACAACCCAAAAAACA-3′)對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積20 μL，模板DNA 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTP混合物1 μL，熱啟動(dòng)Taq酶1 U。94 ℃變性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃延伸10 min。雙蒸水代替DNA進(jìn)行PCR作陰性對(duì)照。20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測(cè)序。

1.4細(xì)胞總RNA提取及RT-PCR檢測(cè)Trizol法提取經(jīng)5-aza-dC和DMSO處理后的細(xì)胞總RNA，甲醛電泳檢測(cè)RNA完整性，-20 ℃保存。

取結(jié)腸癌細(xì)胞系RNA 5 μL，70 ℃變性5 min后依次加入5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、隨機(jī)引物0.5 μg、MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega公司)300 U，總反應(yīng)體積20 μL。42 ℃反應(yīng)60 min，70 ℃加熱10 min終止反應(yīng)。然后用反轉(zhuǎn)錄液進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)引物序列為5′-ACTTTCCCAATCTGCCCTAC-3′，5′-TTCTGGATTGTAGCAGATCA-3′，β-actin作內(nèi)對(duì)照，電泳分析。

2 結(jié) 果

2.1多重PCR結(jié)果GSTM1非空白基因型的DNA樣品，經(jīng)PCR擴(kuò)增后為273 bp、170 bp兩條帶，而空白基因型只有170 bp一條帶(圖1)。模板中即使只有1個(gè)基因拷貝，經(jīng)PCR擴(kuò)增后也有產(chǎn)物產(chǎn)生。因此，非空白基因型包括有兩個(gè)基因拷貝的純合子和只有一個(gè)基因拷貝的雜合子，而空白基因型則為純合子基因缺失。結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、SW480、SW1116為GSTM1非空白基因型，而HCT116、Lovo、Colo結(jié)腸癌細(xì)胞系為GSTM1空白基因型。

圖1結(jié)腸癌細(xì)胞系中GSTM1基因型檢測(cè)結(jié)果

Fig.1 Genotypes of GSTM1 in colon cancer cell lines

2.2MSP結(jié)果GSTM1基因在5個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、HCT116、SW480、Lovo、Colo中呈啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，而在SW1116細(xì)胞中主要為非甲基化狀態(tài)，甲基化條帶也有擴(kuò)增(圖2)。

2.3RT-PCR結(jié)果在5個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、HCT116、SW480、Lovo、Colo中RT-PCR方法檢測(cè)無(wú)GSTM1基因擴(kuò)增，僅SW1116細(xì)胞中有GSTM1基因擴(kuò)增。細(xì)胞經(jīng)過(guò)5-aza-dC去甲基化處理后，發(fā)現(xiàn)在HT29和SW480細(xì)胞中GSTM1基因表達(dá)復(fù)活，而HCT116、Lovo、Colo細(xì)胞中GSTM1仍無(wú)擴(kuò)增(圖3)。

圖2結(jié)腸癌細(xì)胞系中GSTM1基因啟動(dòng)子甲基化結(jié)果及測(cè)序圖

Fig.2 MSP and sequencing results of GSTM1 promoter in colon cancer cell lines

m：甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物；u：非甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖35-aza-dC處理結(jié)腸癌細(xì)胞系后GSTM1基因表達(dá)變化

Fig.3 RT-PCR result of GSTM1 gene expression in colon cancer cell lines treatedwith 5-aza-dC

3 討 論

目前多認(rèn)為腫瘤的發(fā)生受到遺傳和環(huán)境因素的共同影響。致癌物質(zhì)代謝過(guò)程中個(gè)體基因型的不同可參與決定個(gè)體發(fā)生腫瘤的易患性。環(huán)境與基因共同作用與腫瘤發(fā)生的關(guān)系越來(lái)越受到研究者的注意。GSTM1是Ⅱ相代謝酶GSTs家族的成員，參與外源化合物的代謝解毒過(guò)程[1]。即GSTM1基因表達(dá)水平低，則GSTM1酶活性降低，對(duì)外界致癌物、致突變物的代謝能力下降，腫瘤易患性增加。

國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究報(bào)道GSTM1表達(dá)水平與結(jié)腸癌發(fā)生密切相關(guān)。其中從遺傳角度分析GSTM1基因型與結(jié)腸癌易患性的研究結(jié)論不一，存在爭(zhēng)議。GSTM1(-/-)稱為GSTM1空白基因型，該基因型個(gè)體不能表達(dá)GSTM1，因而酶活性下降。國(guó)外有學(xué)者研究認(rèn)為GSTM1空白基因型與結(jié)腸癌發(fā)生相關(guān)[2-4]，但是也有學(xué)者分析結(jié)腸癌患者基因型后，認(rèn)為結(jié)腸癌的發(fā)生與GSTM1空白基因型不相關(guān)[5]。因此，我們推測(cè)GSTM1基因表達(dá)是否不僅只受到遺傳層面的調(diào)控。

表觀遺傳調(diào)控是在不改變基因序列的情況下，對(duì)DNA或者組蛋白進(jìn)行特定修飾，進(jìn)而影響基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控方式。其中DNA甲基化是重要的表觀遺傳調(diào)控方式之一?；騿?dòng)子區(qū)高度甲基化可引起該基因轉(zhuǎn)錄抑制、表達(dá)靜默。國(guó)外研究報(bào)道GSTM1基因啟動(dòng)子甲基化與多種腫瘤密切相關(guān)，如可能與頭頸部腫瘤發(fā)生相關(guān)[6]，還與急性白血病的預(yù)后有關(guān)[7]。但是目前無(wú)研究報(bào)道細(xì)致分析結(jié)腸癌細(xì)胞系中GSTM1基因的表達(dá)狀態(tài)、遺傳基因型、DNA甲基化狀態(tài)及其三者之間的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)6個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系中除了SW1116細(xì)胞以外，均存在GSTM1基因表達(dá)缺失，而其中只有HCT116、Lovo、Colo 3種細(xì)胞系為GSTM1空白基因型，而且其GSTM1基因啟動(dòng)子呈甲基化狀態(tài)，但是去甲基化藥物不能使GSTM1表達(dá)復(fù)活，故其GSTM1基因表達(dá)缺失是遺傳學(xué)空白基因型造成的；另外，HT29、SW480細(xì)胞系中GSTM1基因表達(dá)缺失，但是甲基化分析表明此兩種細(xì)胞系中GSTM1基因呈啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，去甲基化藥物處理后，基因表達(dá)復(fù)活，故此兩種細(xì)胞系中GSTM1基因表達(dá)缺失是由DNA甲基化造成，GSTM1基因并非為空白基因型。SW1116細(xì)胞中GSTM1基因?yàn)榉强瞻谆蛐?，而且啟?dòng)子主要呈現(xiàn)非甲基化狀態(tài)，可以檢測(cè)到GSTM1基因表達(dá)，提示SW1116結(jié)腸癌細(xì)胞系中GSTM1基因不受以上遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)調(diào)控。

以上研究結(jié)果證明GSTM1基因表達(dá)缺失是由于空白基因型和DNA甲基化兩種方式共同引起。與GSTM1基因類(lèi)似的受到遺傳和表觀遺傳共同調(diào)控的基因很多，例如抑癌基因RUNX3。雜合缺失和啟動(dòng)子甲基化均調(diào)控RUNX3表達(dá)[8]。因而在腫瘤相關(guān)基因研究中，需要結(jié)合遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)。既往單獨(dú)從遺傳學(xué)角度分析GSTM1基因型與結(jié)腸癌關(guān)系的研究不夠全面，未來(lái)需要進(jìn)一步結(jié)合兩者共同分析。尤其是完善結(jié)腸癌實(shí)體腫瘤中GSTM1基因型和DNA甲基化狀態(tài)的研究更具有重要意義。另外，如何利用DNA甲基化的可逆性，調(diào)控GSTM1基因表達(dá)，提高其酶活性，降低腫瘤易患性，也是有意義的課題，有可能為GSTM1基因與結(jié)腸癌相關(guān)性研究提供更多的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] HOENSCH H, PETERS WH, ROELOFS HM, et al. Expression of the glutathione enzyme system of human colon mucosa by localization, gender and age[J]. Curr Med Res Opin, 2006, 22(6):1075-1083.

[2] KOH WP, NELSON HH, YUAN JM, et al. Glutathione S-transferase(GST) gene polymorphisms, cigarette smoking and colorectal cancer risk among Chinese in Singapore[J]. Carcinogenesis, 2011, 32(10):1507-1511.

[3] WANG J, JIANG J, ZHAO Y, et al. Genetic polymorphisms of glutathione S-transferase genes and susceptibility to colorectal cancer: a case-control study in an Indian population[J]. Cancer Epidemiol, 2011, 35(1):66-72.

[4] ZUPA A, SQAMBATO A, BIANCHINO G, et al. GSTM1 and Nat2 polymorphisms and colon, lung and bladder cancer risk: a case-control study[J]. Anticancer Res, 2009, 29(5):1709-1714.

[5] CSEJTEI A, TIBOLD A, VARGA Z, et al. GSTM1, GSTT and p53 polymorphisms as modifiers of clinical outcome in colorectal cancer[J]. Anticancer Res, 2008, 28(3B):1917-1922.

[6] SHARMA R, PANDA NK, KHULLAR M. Hypermethylation of carcinogen metabolism genes, CyP1A1, CYP2A13 and GSTM1 genes in head and neck cancer[J]. Oral Dis, 2010,16(7):668-673.

[7] OHGAMI RS, MA L, REN L, et al. DNA methylation analysis of ALOX12 and GSTM1 in acute myeloid leukaemia identifies prognostically significant groups[J]. Br J Haematol, 2012, 159(2):182-190.

[8] XIAO WH, LIU WW. Hemizygous deletion and hypermethylation of RUNX3 gene in hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2004, 10(3):376-380.