【摘 要】雞新城疫（雞瘟）是雞的一種烈性傳染病，是由雞新城疫病毒引起的一種急性高度傳染性疾病。免疫預(yù)防是重要的防治手段，但影響免疫效果的因素有很多，諸如疫苗的質(zhì)量、其他疫病的影響、強(qiáng)毒感染和變異株出現(xiàn)、免疫時(shí)間和免疫程序不當(dāng)、雞場(chǎng)環(huán)境衛(wèi)生較差等。尤其是疫苗的保存溫度對(duì)疫苗的效價(jià)影響最大。為此，我們對(duì)雞新城疫疫苗設(shè)置不同溫度刺激半小時(shí)稀釋后免疫，以期找出解決影響免疫效果因素的方法和為疫苗合適的保存溫度提供佐證材料。

【關(guān)鍵詞】雞新城疫；抗體；血凝；血凝抑制

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 雞新城疫（ND）凍干苗

來(lái)源于遵義市動(dòng)物疫病控制中心。

1.1.2 試驗(yàn)雞群

來(lái)源于遵義市紅花崗區(qū)深溪、南關(guān)兩個(gè)鎮(zhèn)蛋雞、肉雞6戶(hù)養(yǎng)殖大戶(hù)，共計(jì)6000羽。

1.1.3 主要試劑

檸檬酸三鈉、重鉻酸鉀、硫酸、0.9% 生理鹽水、PBS液。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

96孔V型微量血凝板、單道和八道微量精密移液器、加樣槽、吸嘴、微型振蕩器、離心機(jī)、恒溫箱。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

2009年12月，在深溪、南關(guān)兩鎮(zhèn)選定了蛋雞、肉雞養(yǎng)殖各3戶(hù)進(jìn)行雞群免疫。實(shí)驗(yàn)室工作于2011年8～12月在紅花崗區(qū)農(nóng)牧局動(dòng)物疾病控制中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3 影響疫苗免疫效果因素分析

1.3.1 是疫苗檢查不嚴(yán)影響免疫效果

（1）瓶蓋檢查。檢查瓶蓋是否松動(dòng)、脫落。瓶蓋松動(dòng)、脫落的疫苗因其密閉保存條件改變會(huì)使疫苗的抗原性（免疫原性）降低進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的效價(jià)降低、失效甚至產(chǎn)生副作用。

（2）標(biāo)簽檢查。檢查標(biāo)簽上的生產(chǎn)批文批號(hào)、生產(chǎn)日期、疫苗性狀、保存條件、保存時(shí)間、使用劑量。沒(méi)有取得生產(chǎn)批文批號(hào)的疫苗質(zhì)量不可靠；生產(chǎn)日期和保存時(shí)間的檢查主要看疫苗是否超過(guò)保存期，超過(guò)保存期的疫苗效抗原性（免疫原性）降低或消失，進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的效價(jià)降低、效價(jià)差，甚至失效；保存條件是否與標(biāo)簽上規(guī)定的條件一致，不符合標(biāo)簽規(guī)定保存條件保存的疫苗，疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的效價(jià)降低甚至失效。

1.3.2 疫苗保存不當(dāng)影響免疫效果

（1）保存溫度不當(dāng)。保存溫度過(guò)高要或過(guò)低均會(huì)使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的效價(jià)降低甚至失效。

（2）保存避光不當(dāng)。疫苗保存需要避光保存，如果避光條件不好也會(huì)使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的效價(jià)降低甚至失效。

1.3.3 疫苗使用操作不當(dāng)影響免疫效果

（1）疫苗稀釋不當(dāng)。疫苗稀釋不當(dāng)有幾種情況：不用規(guī)定的稀釋液稀釋疫苗；不按規(guī)定的稀釋劑量稀釋疫苗；稀釋液與疫苗溫差太大，會(huì)使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失。

（2）疫苗使用不當(dāng)。疫苗使用不當(dāng)有幾種情況：不按規(guī)定的使用方法使用；不按規(guī)定的使用劑量使用；使用器械、注射部位消毒不嚴(yán)。

（3）使用過(guò)程中保管不當(dāng)。疫苗在稀釋后使用過(guò)程中因保管不當(dāng)，使稀釋后的疫苗長(zhǎng)時(shí)間置于強(qiáng)光或高溫環(huán)境下會(huì)使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的效價(jià)降低甚至失效。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)分組

將雞新城疫（ND）疫苗從低溫冰箱拿出后，分別在15～60℃（以5℃為梯度）恒溫條件下保存30min后稀釋進(jìn)行免疫，從低溫冰箱拿出后立即稀釋免疫，并設(shè)空白對(duì)照組。試驗(yàn)總共12組。

1.4.2 1%紅細(xì)胞懸液制備[5， 6]

由健康雞心臟或翅靜脈采血，放入加有抗凝劑的離心管內(nèi)（按抗凝劑：全血=1：2的比例），迅速混勻。在離心機(jī)中以3000轉(zhuǎn)/min離心5min，用吸管吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，將沉淀的紅細(xì)胞加生理鹽水，慢慢混合均勻，再在離心機(jī)中3000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去上清液，再加生理鹽水混勻，如此反復(fù)離心4～5次，最后一次離心后的紅細(xì)胞，棄去上清液，即為紅細(xì)胞泥。放入4℃冰箱中可保存2～3天。使用時(shí)用1ml吸管吸取0.1ml紅細(xì)胞泥，然后加入9.9ml的生理鹽水，此即1%紅細(xì)胞懸液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.3 血清制備

每只雞翅靜脈采血0.5～1ml，靜置待血清析出后或離心備用。

1.4.4 血凝（HA）試驗(yàn)[7，8～15]

①先用微量移液器向96孔V型反應(yīng)板的每孔加生理鹽水25μl；

②用微量移液器吸取待測(cè)抗原25μl于第一孔中并抽吸6次混合，后吸出25μl至第2孔，依次倍比稀釋到第11孔，棄去25μl；

③微量移液器再吸取1%紅細(xì)胞懸液依次加入各孔，每孔25μl；

④置于微量振蕩器上振蕩1min后室溫（18～22℃）靜置30min觀察結(jié)果；

⑤將反應(yīng)板傾斜成45°，沉于孔底的紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線(xiàn)狀流動(dòng)者為沉淀，表明紅細(xì)胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，說(shuō)明紅細(xì)胞被病毒凝集。能使雞紅細(xì)胞完全凝集的抗原的最高稀釋倍數(shù)，稱(chēng)為該抗原滴度紅細(xì)胞凝集效價(jià)。即沉淀的前一孔即為該抗原的效價(jià)。

⑥4單位抗原校正，按逐級(jí)稀釋的方法將抗原作相應(yīng)稀釋后的HA試驗(yàn)，當(dāng)從第五孔開(kāi)始為完全沉淀，所以表明所配4單位抗原準(zhǔn)確。

1.4.5 血凝抑制（HI）試驗(yàn)

每排孔檢查1份血清。步驟如下：

①微量移液器先加25μl生理鹽水于各孔中；

②用微量移液器吸取待檢血清25μl置于第1孔中，然后倍比稀釋至第11孔，棄去25μl，最后一孔不稀釋?zhuān)瑸榧t細(xì)胞對(duì)照；

③用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25μl；

④置于微量振蕩器上振蕩1min，混合均勻；

⑤室溫靜置20min；

⑥用微量移液器吸取1%紅細(xì)胞懸液于每孔各加25μl；

⑦置于微量振蕩器上振蕩1min，混合均勻，室溫靜置40min后觀察結(jié)果；

⑧結(jié)果判定：以完全抑制紅細(xì)胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度，以2的指數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 血凝（HA）試驗(yàn)結(jié)果

HA試驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)用抗原在微量反應(yīng)板倍比稀釋第8孔完全凝集1%紅細(xì)胞，其抗原效價(jià)為1：256。并對(duì)4單位抗原作了校正，4單位抗原校正成立。

2.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn)結(jié)果與分析

空白對(duì)照組：空白對(duì)照組免疫抗體效價(jià)為log4。常規(guī)對(duì)照組：常規(guī)對(duì)照組免疫抗體效價(jià)為log64。試驗(yàn)組：試驗(yàn)組各溫度段疫苗免疫抗體效價(jià)分別是15℃為log64；20℃為log32；25℃為log16；30℃為log8；35℃為log8；40℃為log8；45℃為log4；50℃為log4；55℃為log4；60℃為log4。

由上可知，溫度上升1個(gè)梯度（5℃）刺激疫苗30min，疫苗免疫抗體滴度降低1個(gè)滴度，當(dāng)溫度上升到40℃及40℃以上刺激疫苗30min，疫苗失去有效抗原性。當(dāng)處置溫度≤25℃時(shí)疫苗免疫均有效。

2.3 過(guò)期疫苗、保質(zhì)期內(nèi)瓶塞松動(dòng)疫苗、性狀顏色與標(biāo)簽不符疫苗免疫效價(jià)檢測(cè)分析

過(guò)期疫苗免疫抗體效價(jià)為log2；保質(zhì)期內(nèi)（過(guò)一半保存期）瓶塞松動(dòng)疫苗免疫抗體效價(jià)為log2；性狀顏色與標(biāo)簽不符疫苗免疫效價(jià)為log0。

3 結(jié)論與討論

3.1 影響疫苗效價(jià)的因素

3.1.1 疫苗質(zhì)量

除正規(guī)合法的廠家生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量能保證外，新城疫凍干苗潮濕、瓶蓋松動(dòng)均能影響疫苗的質(zhì)量，進(jìn)而影響疫苗的效價(jià)。

3.1.2 保存溫度

疫苗從出廠到代理商，再到養(yǎng)殖戶(hù)的過(guò)程中可能要經(jīng)過(guò)多次的融凍，雖然標(biāo)簽在有效期之內(nèi)，但效價(jià)已經(jīng)明顯降低，甚至失效。我們研究結(jié)果顯示，疫苗從低溫保存設(shè)備拿出后立即稀釋進(jìn)行免疫的常規(guī)操作，與在25℃溫度刺激疫苗30min后稀釋免疫均能達(dá)到有效免疫效果，但高于25℃溫度對(duì)疫苗進(jìn)行刺激后免疫達(dá)不到有效免疫的效果。

3.1.3 外界環(huán)境

天氣突變、通風(fēng)不良、舍內(nèi)氨氣過(guò)濃等應(yīng)激因素都會(huì)影響免疫效果。而飼料營(yíng)養(yǎng)不均衡也影響免疫效果。

3.1.4 其他因素

此外，疫苗正確的稀釋和免疫方式是免疫質(zhì)量保證的關(guān)鍵。而雞體內(nèi)的母源抗體、疫苗之間相互干擾、消毒藥與抗病毒藥、機(jī)體抵抗力、合理免疫程序均影響疫苗效價(jià)。

3.2 免疫過(guò)程中影響免疫效果的因素

3.2.1 疫苗檢查不嚴(yán)影響免疫效果

（1）瓶蓋檢查。檢查瓶蓋是否松動(dòng)、脫落。瓶蓋松動(dòng)、脫落的疫苗因其密閉保存條件改變會(huì)使疫苗的抗原性（免疫原性）降低進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的效價(jià)降低、失效甚至產(chǎn)生副作用。

（2）標(biāo)簽檢查。檢查標(biāo)簽上的生產(chǎn)批文批號(hào)、生產(chǎn)日期、疫苗性狀、保存條件、保存時(shí)間、使用劑量。沒(méi)有取得生產(chǎn)批文批號(hào)的疫苗質(zhì)量不可靠；生產(chǎn)日期和保存時(shí)間的檢查主要看疫苗是否超過(guò)保存期，超過(guò)保存期的疫苗效抗原性（免疫原性）降低或消失進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的效價(jià)降低價(jià)差甚至失效；保存條件是否與標(biāo)簽上規(guī)定的條件一致，不符合標(biāo)簽規(guī)定保存條件保存的疫苗，疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的效價(jià)降低甚至失效；疫苗性狀是否與標(biāo)簽上描述的性狀一致，與標(biāo)簽上描述的性狀不一致的疫苗已變性（變質(zhì)），可能導(dǎo)致效價(jià)降低、失效甚至產(chǎn)生副作用。

3.2.2 疫苗保存不當(dāng)影響免疫效果

（1）保存溫度不當(dāng)。保存溫度過(guò)高要或過(guò)低均會(huì)使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的效價(jià)降低甚至失效。

（2）保存避光不當(dāng)。疫苗保存需要避光保存，如果避光條件不好也會(huì)使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的效價(jià)降低甚至失效。

3.2.3 疫苗使用操作不當(dāng)影響免疫效果

（1）疫苗稀釋不當(dāng)。疫苗稀釋不當(dāng)有幾種情況：不用規(guī)定的稀釋液稀釋疫苗；不按規(guī)定的稀釋劑量稀釋疫苗；稀釋液與疫苗溫差太大，會(huì)使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失。

（2）疫苗使用不當(dāng)。疫苗使用不當(dāng)有幾種情況：不按規(guī)定的使用方法使用；不按規(guī)定的使用劑量使用；使用器械、注射部位消毒不嚴(yán)。都會(huì)使疫苗的抗原性（免疫原性）在家禽免疫應(yīng)答過(guò)程中不能充分發(fā)揮進(jìn)而影響免疫抗體的形成導(dǎo)致免疫效果受影響。

（3）使用過(guò)程中保管不當(dāng)。疫苗在稀釋后使用過(guò)程中因保管不當(dāng)，使稀釋后的疫苗長(zhǎng)時(shí)間置于強(qiáng)光或高溫環(huán)境下會(huì)使疫苗的抗原性（免疫原性）降低或消失，進(jìn)而導(dǎo)致疫苗的效價(jià)降低甚至失效。

3.3 保證疫苗效價(jià)的綜合措施

一是從正規(guī)廠家進(jìn)購(gòu)疫苗，并在使用時(shí)仔細(xì)檢查瓶蓋是否松動(dòng)、脫落，按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行稀釋和免疫。

二是正確的疫苗保存、運(yùn)輸方式，根據(jù)疫苗類(lèi)型選擇相應(yīng)的保存方式，在運(yùn)輸過(guò)程中根據(jù)疫苗類(lèi)型（需常溫或低溫保存）和運(yùn)輸距離選擇合理的運(yùn)輸保溫方式，立即使用的需低溫保存的疫苗在短距離運(yùn)輸時(shí)可選擇冰盒等簡(jiǎn)便的保溫設(shè)備。盡量減少運(yùn)輸次數(shù)和反復(fù)凍融次數(shù)。

三是選擇合理的免疫時(shí)間。盡量選擇在早晨或傍晚氣溫較低時(shí)候進(jìn)行免疫，溫度過(guò)高不僅影響疫苗質(zhì)量，而且應(yīng)激反應(yīng)大。根據(jù)雞群年齡及健康狀況適時(shí)進(jìn)行免疫。

四是實(shí)驗(yàn)室時(shí)保持合適的溫度。溫度的高低影響到抗原、抗體及紅細(xì)胞的活性的高低，溫度過(guò)高時(shí)會(huì)破壞紅細(xì)胞表面的凝集素，溫度過(guò)低時(shí)出現(xiàn)不凝集或不抑制現(xiàn)象而使監(jiān)測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，所以在實(shí)驗(yàn)前必須將所有需要用的物品達(dá)到室溫下才能進(jìn)行檢測(cè)，最適宜溫度為18～25℃。

五是掌握正確的判定標(biāo)準(zhǔn)。每做一批試驗(yàn)設(shè)1孔為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照孔作為參照（也可作為抗原含量的間接效價(jià)），以紅細(xì)胞與病毒的凝集完全被抑制的孔來(lái)確定HI抗體滴度。即豎放微量板讓沉積的紅細(xì)胞能自然流動(dòng)的最后孔為HI價(jià)。

3.4 解決免疫過(guò)程中影響免疫效果因素的方法

3.4.1 針對(duì)疫苗檢查不嚴(yán)采取的措施

（1）認(rèn)真檢查瓶蓋。發(fā)現(xiàn)瓶蓋松動(dòng)、脫落的疫苗不能使用。

（2）認(rèn)真檢查標(biāo)簽。沒(méi)有取得生產(chǎn)批文批號(hào)的；生產(chǎn)日期和保存時(shí)間超過(guò)保存期；保存條件是否與標(biāo)簽上規(guī)定的條件一致的；疫苗性狀是與標(biāo)簽（或說(shuō)明書(shū)）上描述的性狀不一致的疫苗不能使用。

3.4.2 針對(duì)疫苗保存采取的措施

對(duì)于疫苗的保存通常要求避光低溫保存。但不同的疫苗有具體的不同要求，對(duì)任何一種疫苗都應(yīng)仔細(xì)閱讀其標(biāo)簽和說(shuō)明書(shū)，嚴(yán)格按標(biāo)簽和說(shuō)明書(shū)上要求的保存條件進(jìn)行保存疫苗，不能隨意改變疫苗標(biāo)簽和說(shuō)明書(shū)上要求的保存條件，以確保疫苗有效地進(jìn)行保存。杜絕因保存不當(dāng)導(dǎo)致疫苗效價(jià)降低甚至失效。

3.4.3 針對(duì)疫苗使用操作不當(dāng)采取的措施

（1）疫苗的稀釋。疫苗的稀釋嚴(yán)格按要求，使用規(guī)定的稀釋液、按規(guī)定的稀釋劑量進(jìn)行稀釋?zhuān)谙♂屢呙鐣r(shí)要注意使稀釋液的溫度與待稀釋的疫苗溫度接近。

（2）疫苗使用。疫苗在使用時(shí)要認(rèn)真閱讀疫苗標(biāo)簽和說(shuō)明書(shū)，嚴(yán)格按標(biāo)簽和說(shuō)明書(shū)上的要求做到按要求的使用劑量、使用方法、使用部位進(jìn)行免疫，同時(shí)使用的器械、注射部位按要求嚴(yán)格消毒。

（3）疫苗使用過(guò)程中的保管。疫苗稀釋后在使用的過(guò)程中要嚴(yán)格做到避光、低溫保存，稀釋后的疫苗不能置于強(qiáng)光照射和高溫環(huán)境下。