鄭慧玲 鮑曉璐 陳志龍

【摘要】目的 研究新型AT1受體拮抗劑的降壓活性。方法 利用放射性受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和降壓實(shí)驗(yàn)評價(jià)化合物對AT1受體親和力大小以及體內(nèi)降壓活性。結(jié)果 與陽性對照氯沙坦相比，1號化合物有更好的AT1受體親和力。結(jié)論 1號化合物具有較好的降壓效果。

【關(guān)鍵詞】高血壓；細(xì)胞；新型AT1

高血壓是一種常見的心血管疾病，在人群中有相當(dāng)高的致病率和死亡率。我國當(dāng)前有1.6億高血壓患者，而且每年還以300萬人新發(fā)病遞增，每年因心腦血管合并癥而死亡的有260萬人，嚴(yán)重影響了人民的生命和健康。自從第一個(gè)血管緊張素II受體拮抗劑—氯沙坦在瑞典問世以來，人們對沙坦類藥物的作用機(jī)制、藥理作用、臨床效果的認(rèn)識(shí)不斷更新，在心腦血管疾病的防治中應(yīng)用越來越廣泛，而且越來越受到臨床上的重視。最新研究報(bào)告顯示，長期服用沙坦類藥物的高血壓患者，患癌癥的幾率遠(yuǎn)低于不服用沙坦類藥物的人群，從而揭開了沙坦類藥物具有抗腫瘤作用的新篇章。

世界衛(wèi)生組織（WHO）建議的血壓測量標(biāo)準(zhǔn)是：正常成人收縮壓應(yīng)小于或等于140 mmHg（18.6kPa），舒張壓小于或等于90 mmHg（12kPa）。如果成人收縮壓大于或等于160 mmHg（21.3kPa），舒張壓大于或等于95 mmHg（12.6kPa）則為高血壓；血壓值在上述兩者之間，為臨界高血壓。全球高血壓的患病人數(shù)逐年增加，調(diào)查表明高血壓的發(fā)病年齡逐漸趨于年輕化。據(jù)2009年國際高血壓學(xué)會(huì)第21屆年會(huì)報(bào)道，目前全球大約有9.72億人患高血壓或血壓偏高，相當(dāng)于成年人口的26.4%，發(fā)達(dá)國家高血壓患者有3.33億人，發(fā)展中國家有6.39億人。預(yù)計(jì)到2025年，這一數(shù)字將增加到15.6億。目前龐大的市場被國外產(chǎn)品壟斷，國內(nèi)沙坦類降壓新藥的研發(fā)還需突破和發(fā)展。

血管緊張素II受體拮抗劑（沙坦類藥物）是一類特異性高、耐受性好、而且副作用小、安全可靠的新型抗高血壓藥物。本文以BMS-180560為先導(dǎo)化合物，通過構(gòu)效分析、生物電子等排和結(jié)構(gòu)拼合等藥物設(shè)計(jì)基本方法，設(shè)計(jì)合成了化合物1，并進(jìn)行了活性評價(jià)。

關(guān)鍵詞：血管緊張素II 受體1，拮抗劑，高血壓，

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SHR（中國科學(xué)院斯萊科上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

2 材料

2.1 材料與儀器

新型化合物：東華大學(xué)生物醫(yī)藥研究組；EP214C型電子分析天平： SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)：蘇州凈化；SN—682型γ計(jì)數(shù)器：上海日環(huán)廠；上海一恒科學(xué)儀器有限公司； ZH-HX-Z無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測量分析系統(tǒng)：淮北正和生物公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱：Thermo Scientific。

3 實(shí)驗(yàn)方法

25I-Ang II溶液配制：取0.012g（12mg）125I-AngII，加1ml PBS溶解，得到濃度10-2M。

細(xì)胞鋪板：取血管平滑肌細(xì)胞3-7代鋪于24孔板中（1×107/孔），貼壁后用于試驗(yàn)。

3.1 結(jié)合反應(yīng)：每個(gè)濃度采用3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞板每孔依次加入濃度逐漸增加的125I-Ang II溶液，使其終濃度分別為0nM；0.02nM；0.04nM；0.08nM；0.16nM；0.32nM；0.64nM；1.5nM，為了扣除非特異性結(jié)合，每個(gè)濃度的第三個(gè)平行復(fù)孔加入未標(biāo)記的Ang II（終濃度為1×10-6 M）和濃度遞增的125I-Ang II溶液，每孔的最終體積為1000μL（其中500μL為細(xì)胞培養(yǎng)液），4℃反應(yīng)150 min，反應(yīng)結(jié)束后去除多余的反應(yīng)液，用PBS洗滌3次，加入0.1mol/L NaOH溶液消化細(xì)胞10min，將細(xì)胞消化液移入塑料管，用γ計(jì)數(shù)器測量每管內(nèi)溶液的γ計(jì)數(shù)。經(jīng)GraphPad Prism4飽和曲線擬合程序處理得到125I-Ang II受體結(jié)合飽和曲線。

3.1 競爭性實(shí)驗(yàn)：

藥物溶液：取一定量的化合物溶于1 mL的DMSO溶液，濃度為10-2 M，再10倍稀釋成不同濃度的溶液（1×10-10 M ～1×10-4 M）。

細(xì)胞鋪板（1×107/孔）后，每孔加入0.1 nM 125I-Ang II以及不同濃度的新化合物（終濃度1×10-6 ～ 1×10-12 mol/L），總體積為1000 μL，4℃反應(yīng)150 min，反應(yīng)結(jié)束后去除游離的125I-Ang II，用PBS洗滌3次，加入0.1 mol/L NaOH溶液消化10 min，將細(xì)胞液移入塑料管，用γ計(jì)數(shù)器測量每管內(nèi)溶液的γ計(jì)數(shù)。經(jīng)GraphPad Prism 4競爭結(jié)合曲線擬合程序處理即可得出新型化合物抑制與膜蛋白結(jié)合的半抑制常數(shù)和IC50值。

3.2 體內(nèi)降壓實(shí)驗(yàn)

低劑量組（10mg/kg）、高劑量組（15mg/kg、陽性對照組（洛沙坦 10mg/kg）、陰性對照組。

方法：（1）大鼠加溫和固定：采用全身加溫加溫。固定采用有機(jī)玻璃固定器。2）確定起始脈搏水平：將鼠尾依次穿過尾套和脈搏換能器，調(diào)整尾巴位置和儀器增益，使尾動(dòng)脈脈搏信號足夠大。（3）測定血壓：用橡皮球充氣加壓，使尾套內(nèi)壓力升高至脈搏完全消失，再加壓20-30mmHg（2.66～3.99），然后緩慢放氣減壓直至脈搏信號恢復(fù)起始水平，這時(shí)從測壓儀的顯示屏上就可讀取收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓和心率，連續(xù)測3次，取其平均值作為測定值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 4作圖軟件和Excel2007軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并制作圖表，組間差異比較采用方差分析，數(shù)據(jù)采用x±s表示。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5.1 經(jīng)過GraphPad Prism 4競爭結(jié)合曲線擬合軟件處理后得出IC50值，其中，氯沙坦和新型化合物的IC50分別為 1.27±0.23，3.98±1.21，可見兩者的數(shù)據(jù)具有顯著性差異（P<0.01）。

5.2 經(jīng)過無創(chuàng)微動(dòng)脈血壓儀測出了新型化合物的最大降壓值，低劑量組中新化合物給藥后在1-3h里血壓出現(xiàn)明顯降低趨勢，在第三個(gè)小時(shí)達(dá)到最大降壓值28 mmHg，隨后血壓保持平穩(wěn)，直至24小時(shí)后低劑量組與陰性對照相比仍有顯著性差異。而在高劑量治療組中，新化合物給藥后在1-3h里血壓出現(xiàn)明顯降低趨勢，在第三個(gè)小時(shí)達(dá)到最大降壓值30 mmHg，隨后血壓保持平穩(wěn)。

6 討論

從受體結(jié)合試驗(yàn)的和體內(nèi)降壓實(shí)驗(yàn)中可以看出，新型化合物1具有較好的降壓效果，降壓時(shí)間長，效果穩(wěn)定，可以作為新藥進(jìn)行進(jìn)一步的研究。