王樹昌

摘 要 利用pCAMBIA3300載體為背景，構(gòu)建PRSV CP-VPg嵌合型植物表達(dá)干擾載體pCambia-hpRNA-CV，通過花粉管通道法將PRSV CP-VPg嵌合型植物表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化番木瓜，并將獲得的轉(zhuǎn)化番木瓜種子依次進(jìn)行除草劑（PPT）篩選、PCR檢測。結(jié)果表明：獲得轉(zhuǎn)基因番木瓜植株5株，且RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明了目標(biāo)片段在轉(zhuǎn)基因株系中得到表達(dá)。采用人工摩擦接種法對轉(zhuǎn)基因番木瓜株系進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因番木瓜植株對PRSV病毒表現(xiàn)出抗病特性，說明hpRNA-CV成功的干擾了病毒基因的復(fù)制。該研究結(jié)果為番木瓜抗PRSV育種提供了一種有效的研究手段。

關(guān)鍵詞 番木瓜；嵌合型ihpRNA；花粉管通道法轉(zhuǎn)化；PRSV

中圖分類號(hào) Q949.759.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract A plant expression vector containing the chimeric hairpin RNA designed to target two sequences from the CP gene and the VPg gene of PRSV was transferred into papaya plants through pollen-tube pathway， which was constructing base on the pCAMBIA3300 vector. A total of 5 positive transgenic papaya plants were obtained after PPT-resistant selection and PCR analysis. RT-PCR experiments proved that the target segment expressed in the transgenic plants. The result of PRSV challenge-inoculation confirmed the 5 positive transgenic papaya plants didn't displayed symptoms and showed different degrees of resistance to PRSV. Its shown that hpRNA-CV vector interferes the replication of the virus gene successfully. The research provides an effective method for PRSV resistance-breeding of papaya.

Key words Papaya；IhpRNA；Pollen-tube pathway；PRSV

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.011

番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是熱帶、亞熱帶地區(qū)的毀滅性嚴(yán)重的病害，一直威脅著番木瓜種植業(yè)和加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，常規(guī)育種方法還難以防控PRSV。隨著基因工程抗病分子育種的發(fā)展，國內(nèi)外研究人員先后將PRSV外殼蛋白、復(fù)制酶等基因?qū)敕竟汐@得了不同的抗PRSV的轉(zhuǎn)基因株系[1-2]，但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于各地區(qū)PRSV病毒株存在差異，導(dǎo)致一個(gè)地區(qū)的轉(zhuǎn)基因植物在另一個(gè)地區(qū)種植表現(xiàn)出的抗病能力減弱，甚至抗性喪失。因此，培育出穩(wěn)定、高抗、譜抗且安全性好的新品種對發(fā)展中國番木瓜產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

RNA干擾（RNA interference， RNAi）是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。外殼蛋白（Coat Protein， CP）基因介導(dǎo)的病毒抗性是研究最早的，也是目前應(yīng)用最多的抗病毒基因工程，主要的研究集中在體外構(gòu)建重組CP基因表達(dá)框，然后轉(zhuǎn)化植物，繼而使植物獲得對該病毒的抗性[3]。VPg是PRSV一種約25 ku的多功能蛋白，參與病毒侵染過程中的幾個(gè)階段，包括病毒RNA的復(fù)制、病毒細(xì)胞間和長距離運(yùn)輸[4-9]，在病毒侵染過程中具有重要作用。在多種病毒侵染植物的過程中發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)合成起始其重要作用的真核翻譯起始因子eIF4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E）[10]與病毒基因組連接蛋白（Viral genome-linked protein， VPg）的相互作用是病毒侵染植物的必須條件[4，9，11]。在前期的研究工作中，為了獲得高抗、譜抗的轉(zhuǎn)基因抗PRSV番木瓜，構(gòu)建了靶向PRSV基因上2個(gè)部位CP和VPg的嵌合型ihpRNA結(jié)構(gòu)[12]，本研究將通過花粉管通道法將該嵌合基因的iphRNA植物表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化番木瓜，獲得了對PRSV具有明顯的抗病特性的轉(zhuǎn)基因植株，為培育具有中國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、高抗譜抗環(huán)斑病毒番木瓜新品系提供了基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 選取種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所試驗(yàn)基地的番木瓜品種“穗中紅”作為轉(zhuǎn)化受體材料。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌Escherichia coli DH5α菌株、植物表達(dá)載體pCAMBIA3300均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 酶與試劑 各種限制性內(nèi)切酶購自Ferments公司，PCR Mix購自TaKaRa公司，質(zhì)粒、DNA和RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 PRSV CP-VPg嵌合型ihpRNA植物表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 利用重疊PCR技術(shù)，基于PRSV海南分離株CP基因和VPg基因保守序列，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增具有嵌合CP基因和VPg基因的嵌合型ihpRNA結(jié)構(gòu)[12]。然后利用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切位點(diǎn)，將嵌合型ihpRNA結(jié)構(gòu)插入pCAMBIA3300植物表達(dá)載體（圖1），命名為pCambia-hpRNA-CV。采用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對構(gòu)建的pCambia-hpRNA-CV進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.2 質(zhì)粒大量提取和純化 按照QIAGEN質(zhì)粒大量提取試劑盒方法進(jìn)行提取，獲得的質(zhì)粒DNA溶于ddH2O中，終濃度為1 μg/μL，A260/A280比值為1.8左右，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 花粉管通道法遺傳轉(zhuǎn)化番木瓜 選取數(shù)朵未開苞的兩性花（作為轉(zhuǎn)化用的花粉源）置于冰上，在待轉(zhuǎn)化株（雌株）上選定30朵左右未開苞的花（剪去同一花柄上其余花朵），小心逐一剝開花瓣，用微量移液器在雌花花蕾柱頭中央點(diǎn)入3～4 μL重組質(zhì)粒溶液（1 μg/μL），立刻取預(yù)置于冰上的供體兩性花3～4枚雄蕊于柱頭上，合上花瓣，完成人工授粉后套上牛皮管袋隔離保濕，掛上標(biāo)簽（注明導(dǎo)入質(zhì)粒名稱、導(dǎo)入日期及操作時(shí)間）；（同時(shí)用ddH2O為對照，也按上述要求作同步平行操作）。第7天去除牛皮管袋，清除枯萎花苞及其標(biāo)簽，并登記正常生長的子房數(shù)。為保障轉(zhuǎn)基因操作番木瓜果實(shí)生長所需營養(yǎng)的供給，剔除植株頂端其他未進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作的花及果實(shí)。待果實(shí)發(fā)育成熟，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化果實(shí)發(fā)育座果率。將果實(shí)沿中央線縱切開，取出種子，去除假種皮后稍作晾干，播種沙床上育苗。

1.2.4 利用除草劑PPT對轉(zhuǎn)化番木瓜種苗進(jìn)行初篩 待轉(zhuǎn)化番木瓜種苗第一片真葉伸展開時(shí)，利用120 mg/L PPT（1 L溶液中加入20 μL表面活性劑）涂抹幼苗葉片表面及生長點(diǎn)，隔天再涂抹1次。一周后觀察葉片反應(yīng)，剔除葉片變枯黃的株系。

1.2.5 PCR鑒定抗性番木瓜種苗 采用Qiagen DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因番木瓜抗PPT種苗DNA，利用基因片段兩側(cè)引物P1/P2（P1：5′- TTGGTGACGTGCGAAATAGA-3′；P2：5′-TCCAG

ACATATCTGGCTGTATTTTTTTAAT-3′）。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 RT-PCR鑒定抗性番木瓜種苗 采用Qiagen RNA試劑盒小量提取其RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用Tiangen公司KR106-2試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以引物P1/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.7 PRSV接種攻毒試驗(yàn) 使用本實(shí)驗(yàn)室分離保存的PRSV-HN株系，通過人工摩擦接種的手段侵染番木瓜植株。選擇長勢相似的番木瓜植株，用清水將葉片沖洗干凈，并保持液面干燥。用0.1 mol/L PBS緩沖液（pH7.0）制備PRSV-HN病毒液。取保存PRSV-HN菌株的葉片用PBS液體比例為1 ∶ 10（W ∶ V），研磨成汁，低速離心后，取上清液做為毒源，冰上放置待用。病毒液中加入適量滅菌好的石英砂，混勻；用帶乳膠手套的手指蘸取病毒液，沿同一方向輕輕摩擦轉(zhuǎn)ihpRNA番木瓜葉片背面，直至可見少量輕微擦痕。以轉(zhuǎn)pCambia3300的轉(zhuǎn)基因番木瓜為陰性對照。接種5 min后，用無菌水沖洗葉片上多余的病毒液和石英砂；40 d內(nèi)以每周為時(shí)間間隔，觀察病害發(fā)生情況并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pCambia-hpRNA-CV植物表達(dá)載體的鑒定

將獲得的具有pCambia-hpRNA-CV的轉(zhuǎn)化菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取其質(zhì)粒。由圖2可知，工程載體質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得了預(yù)期大小的目標(biāo)條帶；利用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切結(jié)果顯示得到了目標(biāo)條帶，初步鑒定轉(zhuǎn)化菌落是正確的；將此單菌落送往測序，測序得到的核苷酸序列與目標(biāo)序列一致。因此，表明目標(biāo)片段已插入載體中，工程載體構(gòu)建成功。

2.2 轉(zhuǎn)化番木瓜抗PPT種苗的篩選

為得到合適的用于篩選轉(zhuǎn)化番木瓜苗的PPT濃度，將不同濃度PPT溶液涂抹于野生型番木瓜種苗的第一片展開的真葉，3 d后即可觀察葉片出現(xiàn)不同程度的萎蔫。由圖3可知，對照組新葉生長良好，PPT在30～60 mg/L濃度時(shí)，處理真葉出現(xiàn)黑斑，葉片萎蔫，但仍有綠色；而PPT濃度達(dá)到120 mg/L時(shí)，新長成的真葉即可全部萎蔫，效果最佳。一周后，對照組葉片生長旺盛，處理組葉片死亡，沒有新葉發(fā)出。因此，選擇120 mg/L PPT溶液作為篩選濃度。

將篩選獲得的最佳濃度的PPT溶液涂抹于轉(zhuǎn)化種苗第一片展開的真葉上，一周后去除葉子變枯的植株，統(tǒng)計(jì)獲得的番木瓜抗性苗。由表1可知，獲得番木瓜轉(zhuǎn)化抗性苗41株，轉(zhuǎn)化植株篩選效率為17.6% 。

2.3 轉(zhuǎn)化ihpRNA番木瓜種苗PCR鑒定

將抗生素篩選為陽性的41株番木瓜幼苗移栽入溫室，作為檢測對象，以提取的葉片基因組DNA為模板，以插入片段兩側(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以載體質(zhì)粒作為陽性對照模板，以轉(zhuǎn)化有背景載體pCambia3300的轉(zhuǎn)基因植株作為負(fù)對照（沒有目標(biāo)條帶的出現(xiàn)），進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，將獲得目標(biāo)大小片段的轉(zhuǎn)化番木瓜植株作為陽性株系（圖4），本實(shí)驗(yàn)最終獲得pCambia-hpRNA-CV轉(zhuǎn)基因苗5株。

2.4 轉(zhuǎn)化ihpRNA番木瓜種苗RT-PCR驗(yàn)證

提取PCR鑒定為陽性的5株番木瓜植株葉片RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示：篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)為陽性，目標(biāo)片段在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)，目標(biāo)片段成功轉(zhuǎn)入番木瓜內(nèi)（圖5）。轉(zhuǎn)基因植株在形態(tài)、生長發(fā)育狀態(tài)等方面與非轉(zhuǎn)基因植株無明顯差異。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株抗病性分析

通過分子檢測鑒定為陽性轉(zhuǎn)基因株系生長至約50 cm高時(shí)，接種PRSV病毒，3周后發(fā)現(xiàn)，對照組（轉(zhuǎn)pCambia3300株系，見圖6-A）番木瓜植株頂部葉片出現(xiàn)明顯的番木瓜環(huán)斑病癥狀，葉片由剛開始出現(xiàn)水漬斑點(diǎn)，逐漸葉片開始卷曲，新生葉片也出現(xiàn)卷曲，呈發(fā)病狀態(tài)；ihpRNA載體的植株發(fā)病時(shí)間晚于對照組（圖6-C、D），且發(fā)病癥狀明顯減輕，有的株系新生葉逐漸回復(fù)正常。

3 討論與結(jié)論

運(yùn)用RNAi干擾技術(shù)進(jìn)行植物抗病毒工程，通常都是針對目標(biāo)基因單一位點(diǎn)的RNAi干擾載體的構(gòu)建，但病毒基因組小，變異周期相對較短，因此采用針對單一位點(diǎn)的干擾不能滿足實(shí)踐需要。本研究采用的嵌合型ihpRNA載體具有可同時(shí)靶向多個(gè)基因或一個(gè)基因的多個(gè)部位的優(yōu)點(diǎn)，這就可能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對目標(biāo)基因的干擾效率；另一方面，即使生物體發(fā)育過程中基因發(fā)生位點(diǎn)突變，嵌合型ihpRNA結(jié)構(gòu)仍然能夠?qū)ζ溥M(jìn)行有效的干擾。

針對抗PRSV病毒的育種工作已有多年，基本都是圍繞CP基因和PRSV復(fù)制酶基因展開的，主要的研究集中在體外構(gòu)建重組CP基因表達(dá)框，然后轉(zhuǎn)化植物，繼而獲得對該病毒的抗性[12]。國內(nèi)外很多學(xué)者針對番木瓜PRSV病毒展開了研究，也取得了一定的成果。夏威夷大學(xué)的科學(xué)家們[13]將溫和突變體PRSV-CP基因?qū)敕竟?，成功獲得抗PRSV的轉(zhuǎn)基因植株，在2 a內(nèi)無癥狀，但其抗性水平較低。張帆等[14]針對PRSV-CP基因設(shè)計(jì)dsRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化番木瓜植株，結(jié)果表現(xiàn)為抗PRSV。雖然這些轉(zhuǎn)基因番木瓜能夠抗PRSV病毒，但其抗性范圍窄，而且PRSV株系存在顯著區(qū)域差異。針對番木瓜轉(zhuǎn)基因育種中的這些問題，本研究針對PRSV海南分離株，采用融合基因（CP基因和Vpg基因）構(gòu)建ihpRNA載體，進(jìn)而轉(zhuǎn)化番木瓜，以期獲得廣譜的抗病性番木瓜；通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的抗病活性，但其抗病活性能持續(xù)多久，后代是否會(huì)產(chǎn)生衰減現(xiàn)象，有待于進(jìn)一步研究。

對于番木瓜的遺傳轉(zhuǎn)化來說，由于其再生體系尚不完善，轉(zhuǎn)化率低，利用愈傷組織農(nóng)桿菌及基因槍轉(zhuǎn)化率低，很難獲得轉(zhuǎn)基因植株。這些條件的限制使得農(nóng)桿菌、基因槍法轉(zhuǎn)化體系在番木瓜育種中很難得到推廣；另一方面，番木瓜是兩性株、花型大、種子豐富（每個(gè)果實(shí)少則數(shù)十顆，多則數(shù)百顆種子，能夠保證獲得足夠的轉(zhuǎn)化種子）、收獲周期短等性狀特征，使得利用花粉管通道法進(jìn)行番木瓜遺傳轉(zhuǎn)化成為較好的遺傳轉(zhuǎn)化方法。此外，子房滴注法操作簡單，不需要昂貴的儀器設(shè)備，易于被育種工作者所掌握，便于此項(xiàng)技術(shù)的大面積推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] Tecson Mendoza E M， Laurena A C， Botella J R. Recent advances in the development of transgenic papaya technology[J]. Biotechnol Annu Rev， 2008， 14： 423-462.

[2] Gonsalves D. Control of papaya ringspot virus in papaya： a case study[J]. Annu Rev Phytopathol， 1998， 36： 415-437.

[3] 郭興啟， 范國強(qiáng)，尚念科. 植物抗病毒基因工程育種策略及其發(fā)展[J]. 生命科學(xué)研究， 2000， 24（4）： 112-117.

[4] Schaad M C， Anderberg R J， Carrington J C. Strain-specific interaction of the tobacco etch virus NIa protein with the translation initiation factor eIF4E in the yeast two-hybrid system[J]. Virology， 2000， 273（2）： 300-306.

[5] Leonard S， Plante D， Wittmann S， et al. Complex formation between potyvirus VPg and translation eukaryotic initiation factor 4E correlates with virus infectivity[J]. J Virol， 2000， 74（17）： 7 730-7 737.

[6] Khan M A， Miyoshi H， Ray S， et al. Interaction of genome-linked protein（VPg）of turnip mosaic virus with wheat germ translation initiation factors eIFiso4E and eIFiso4F[J]. J Biol Chem， 2006， 281（38）： 28 002-28 010.

[7] Grzela R， Strokovska L， Andrieu J P， et al. Potyvirus terminal protein VPg，effector of host eukaryotic initiation factor eIF4E[J]. Biochimie， 2006， 88（7）： 887-896.

[8] Miyoshi H， Suehiro N， Tomoo K， et al. Binding analyses for the interaction between plant virus genome-linked protein（VPg）and plant translational initiation factors[J]. Biochimie，2006， 88（7）： 329-340.

[9] Roudet-Tavert G， Michon T， Walter J， et al. Central domain of a potyvirus VPg is involved in the interaction with the host translation initiation factor eIF4E and the viral protein HcPro[J]. J Gen Virol， 2007， 88（3）： 1 029-1 033.

[10] von der Haar T， Gross J D， Wagner G， et al. The mRNA cap-binding protein eIF4E in post-transcriptional gene expression[J]. Nat Struct Mol Biol， 2004， 11（6）： 503-511.

[11] Beauchemin C， Boutet N， Laliberte J F. Visualization of the interaction between the precursors of VPg， the viral protein linked to the genome of turnip mosaic virus， and the translation eukaryotic initiation factor iso 4E in Planta[J]. J Virol， 2007， 81（2）： 775-782.

[12] Yan P， Wang S C， Shen W T， et al. Simple construction of chimeric hairpin RNA for virus resistance in plants[J]. Journal of Virological Methods， 2010， 166（1-2）： 101-105.

[13] Fitch M M， Manshardt M R， Gonsalves D， et al. Transgenic papaya plants from agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos[J]. Plant Cell Report， 1993， 12（2）： 245-249.

[14] 張 帆， 江 玲. dsRNA介導(dǎo)的番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）的抗病性研究[J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 29（3）： 385-391.