曹天駿等
摘 要 利用染色體步移法克隆了白木香查爾酮合成酶基因(AsCHS1)ATG上游1 082 bp的啟動(dòng)子序列,該啟動(dòng)子序列中AT含量高達(dá)69.03%,符合真核生物啟動(dòng)子的序列特征。通過(guò)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件分析可知,該序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始位點(diǎn)-65 bp處,并且其上游-25~30 bp區(qū)域存在TATA-box等典型的真核生物啟動(dòng)子核心元件,同時(shí)含有一些順式作用元件如赤霉素應(yīng)答元件GARE-motif、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif、水楊酸應(yīng)答元件TCA-element等激素調(diào)控元件,光應(yīng)答元件BoxⅠ、G-Box、ACE,厭氧誘導(dǎo)元件ARE等。通過(guò)構(gòu)建pC-1 082proAsCHS1植物表達(dá)載體,借助農(nóng)桿菌將重組載體轉(zhuǎn)化到煙草葉片中。蛋白定量結(jié)果表明,該序列可以驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá),具有啟動(dòng)子活性;脫落酸顯著增強(qiáng)該啟動(dòng)子的活性,乙烯則顯著抑制該啟動(dòng)子的活性。
關(guān)鍵詞 白木香;查爾酮合酶;啟動(dòng)子;染色體步移;瞬時(shí)表達(dá);GUS
中圖分類號(hào) Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A
Abstract Based on the Genome Walker strategy,an approximately 1 082 bp sequence was obtained from the DNA of Aquilaria sinensis. Sequence analysis showed that this promoter region contained a TATA-box core element,a CAAT-box, and other cis-acting elements,including an GARE-motif,a TCA element,CGTCA-motif,G-Box,Box I,and a ARE element; these elements are involved in gibberellin responses,salicylic acid responses,methyl jasmonate responses,light response,respectively. The 1 082 bp promoter sequence was inserted in pCAMBIA1381Z vector to construct a fusion vector containing the promoter connected to the GUS gene. GUS quantitative analysis of transgenic Nicotiana benthamiana carrying the pC-1 082proAsCHS1 vector showed that the promoter was active in the leaves. It also showed high activity in the group treated by abscisic acid, while restrained activity in the group treated by ethylene. These results suggest that AsCHS1 may be regulated by this two phytohormones.
Key words Aquilaria sinensis;Chalcone synthases;Promoter;Genome Walker;Transient expression;β-Glucuronidase
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.012
沉香是沉香屬植物,為含樹(shù)脂的木材,是中國(guó)、印度、日本及其他東南亞國(guó)家的名貴藥材和天然香料。白木香[Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg]是中國(guó)沉香的唯一基源植物[1]。白木香主要分布于中國(guó)的海南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣[2]。由于沉香價(jià)值高,長(zhǎng)期以來(lái)白木香遭到掠奪式砍伐,其原始森林已經(jīng)基本破壞殆盡。因此,白木香已被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅱ[3]。
作為藥材,沉香可用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等[4]。對(duì)沉香的化學(xué)成分研究表明,其主要含有2類成分,即倍半萜類化合物和色酮類化合物[5],而未經(jīng)傷害誘導(dǎo)的白木香植物莖干部位則含有大量黃酮類化合物[6-8]。由于色酮類化合物和黃酮類化合物都含有苯并吡喃酮的結(jié)構(gòu)[9],因此推測(cè)沉香中色酮類化合物的產(chǎn)生可能與白木香植物中的黃酮類化合物具有相關(guān)性。
查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是合成黃酮類化合物的關(guān)鍵酶之一,催化香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A生成苯基苯乙烯酮。查爾酮合成酶基因在許多植物中已有克隆并進(jìn)行了相關(guān)研究,如矮牽牛、雪蓮等[10]。查爾酮合成酶也作為苯丙氨酸代謝中的關(guān)鍵酶參與植物防御反應(yīng)[11]。汪孟曦等[12]克隆了白木香查爾酮合成酶基因AsCHS1,AsCHS1在白木香莖干中可提前響應(yīng)逆境脅迫。目前對(duì)白木香中黃酮類化合物的研究也只局限于化學(xué)成分的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定,關(guān)于AsCHS1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。自然條件下沉香的形成所需時(shí)間很長(zhǎng),且含量低,探索提高沉香產(chǎn)量的方法對(duì)充分利用白木香資源具有重要意義[13]。
本研究利用染色體步移法克隆了AsCHS1啟動(dòng)子,并利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其功能進(jìn)行初步鑒定,這為進(jìn)一步研究AsCHS1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及闡明白木香受損傷后其類黃酮物質(zhì)的累積情況奠定了基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
白木香莖組織采集于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所區(qū)內(nèi)五年生白木香樹(shù);本生煙草(Nicotiana benthamiana)種子、大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101菌株、pCAMBIA1381Z植物表達(dá)載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存;用于構(gòu)建染色體步移文庫(kù)的試劑盒LA PCRTM in vitro Cloning Kit、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、T4連接酶和X-gal等均購(gòu)自TaKaRa公司;DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自QIAGEN 公司;普通質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Real-Times公司。
1.2 方法
1.2.1 染色體步移文庫(kù)的構(gòu)建 白木香DNA的提取參照趙翾等[13]的方法進(jìn)行。染色體步移文庫(kù)的構(gòu)建按照TaKaRa公司 LA PCRTM in vitro Cloning Kit使用說(shuō)明書進(jìn)行: (1)使用7種產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶(Sau3AI、HindⅢ、EcoRI、MflI、XbaⅠ、EcoT22I、BamHI)分別對(duì)白木香樹(shù)基因組DNA進(jìn)行酶切消化,使用75%酒精對(duì)酶切消化后的DNA進(jìn)行沉淀并純化; (2)把純化的DNA與試劑盒提供的接頭連接,構(gòu)建成7種染色體步移文庫(kù)(Sau3AI庫(kù)、HindⅢ庫(kù)、EcoRI庫(kù)、MflI庫(kù)、XbaI庫(kù)、EcoT22I庫(kù)、BamhI庫(kù))。
1.2.2 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)AsCHS1的序列(GenBank登錄號(hào):EF103196.1)依次設(shè)計(jì)6條反向特異引物,并以試劑盒提供的引物C1、C2作為正向引物進(jìn)行巢式PCR,設(shè)計(jì)的引物見(jiàn)表1。
1.2.3 AsCHS1啟動(dòng)子的克隆 第1輪PCR反應(yīng):在7個(gè)0.25 mL的PCR管中分別加入7種DNA文庫(kù)0.5 μL,然后分別依次加入10×LA PCR 緩沖液Ⅱ 2 μL,2.5 mmol/L的dNTP 2 μL,引物C1 1 μL,引物S1 1 μL、LA Taq 0.5 μL,補(bǔ)水至20 μL;PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃ 30 s,54 ℃ 2 min,72 ℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。第2輪PCR反應(yīng):分別取第1輪PCR產(chǎn)物1 μL稀釋100倍作為第2輪PCR反應(yīng)的模板,然后依次加入10×LA PCR緩沖液Ⅱ 2 μL、2.5 mmol/L的d NTP 2 μL,引物C2 1 μL,引物S2 1 μL、LA Taq 0.5 μL,總反應(yīng)體系為20 μL;PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃ 30 s,56 ℃ 2 min,72 ℃ 80 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物回收、純化后克隆至pMD19-T載體上并送北京諾賽生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
1.2.6 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草 (1)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒、pCAMBIA1381Z質(zhì)粒分別用電融合法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h,挑取單菌落,使用pCAMBIA1381Z載體引物PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克??; (2)將驗(yàn)證正確的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng),直至至OD600=0.6~0.8,收集菌體后加懸浮液(MES+MgCl2+AS)靜置2 h,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法轉(zhuǎn)化本生煙草,于28 ℃光照氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h; (3)分別向其噴灑工作濃度為50 μmol/L的乙烯(ET)、赤霉素(GA)及100 μmol/L的脫落酸(ABA)、 茉莉酸甲酯(MeJA)、 水楊酸(SA)、吲哚乙酸(IAA), 確保每片葉上均勻覆蓋各激素后,再次放入28 ℃光照氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,檢測(cè)GUS蛋白活性。
1.2.7 GUS活性檢測(cè) (1)取0.1 g煙草樣品用液氮磨成粉末,將粉末轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管,加入400 μL蛋白抽提緩沖液[50 mmoL/L磷酸緩沖液(pH7.0)、0.1% Triton X-100、0.1% SDS、10 mmoL/L β-巰基乙醇、10 mmoL/L Na2-EDTA],混勻,冰上靜置10 min,以12 000 r/min離心10 min后吸取上清,此上清即為總蛋白提取液;(2)采用Bradford[14]的方法測(cè)定總蛋白濃度,將總蛋白提取液與考馬斯亮藍(lán)溶液反應(yīng),用酶標(biāo)儀測(cè)定其總蛋白濃度 (3)采用Jeferson等[15]的方法測(cè)定GUS蛋白活性,結(jié)果以所生成的4-MU的量與總蛋白含量和時(shí)間的比值表示(pmol/mg·min)。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。
2 結(jié)果與分析
2.1 染色體步移文庫(kù)的構(gòu)建
白木香DNA經(jīng)7種限制性內(nèi)切酶酶切后,凝膠電泳均呈現(xiàn)彌散狀分布(圖2),表明DNA酶切充分?;厥彰盖泻蟮腄NA并將其與試劑盒提供的接頭連接,構(gòu)建成染色體步移文庫(kù)。
2.2 AsCHS1啟動(dòng)子的克隆
通過(guò)3次巢式PCR克隆到1 082 bp的啟動(dòng)子(圖3),序列分析表明該啟動(dòng)子有101 bp的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中AsCHS1的翻譯起始位點(diǎn)下游的序列完全一致,表明克隆到了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 082 bp的AsCHS1啟動(dòng)子序列。
2.3 AsCHS1啟動(dòng)子功能元件預(yù)測(cè)分析
對(duì)所獲得的1 082 bp AsCHS1啟動(dòng)子序列進(jìn)行功能元件預(yù)測(cè)分析表明,核心啟動(dòng)子區(qū)域位于-106~-66 bp處,其可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始位點(diǎn)上游65 bp處。采用Plant CARE數(shù)據(jù)庫(kù)和植物順式元件查詢數(shù)據(jù)庫(kù)PLACE,對(duì)AsCHS1啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行分析,結(jié)果顯示(圖4)該序列具有啟動(dòng)子核心序列TATA-box和增強(qiáng)子元件CAAT-box等典型的真核生物啟動(dòng)子基本元件;激素相關(guān)元件如赤霉素應(yīng)答元件GARE-motif、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif以及水楊酸應(yīng)答元件TCA-element等參與激素調(diào)控。同時(shí)還存在光應(yīng)答元件BoxⅠ、G-Box、ACE(表2)。
2.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建
對(duì)構(gòu)建的pC-1082proAsCHS1載體質(zhì)粒進(jìn)行HindⅢ和SalⅠ的單酶切和雙酶切驗(yàn)證,結(jié)果如圖5所示,單酶切結(jié)果線性化,雙酶切出現(xiàn)了插入的1 082 bp的片段,表明了載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。
2.5 AsCHS1啟動(dòng)子激素元件功能的初步鑒定
經(jīng)GUS蛋白定量檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),與作為對(duì)照的水處理組及pCAMBIA1381Z空載體相比,插入該啟動(dòng)子片段后能夠顯著地驅(qū)動(dòng)載體上GUS蛋白的表達(dá)。激素處理結(jié)果表明,ABA對(duì)AsCHS1啟動(dòng)子的活性有顯著的增強(qiáng)作用,ET對(duì)該啟動(dòng)子的活性有顯著的抑制作用,而MeJA、SA、GA和IAA對(duì)AsCHS1啟動(dòng)子的活性沒(méi)有明顯的影響(圖6)。
3 討論與結(jié)論
啟動(dòng)子是基因的一個(gè)重要組成部分,控制基因表達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度,啟動(dòng)子順式作用元件的分析與挖掘?qū)ρ芯炕虮磉_(dá)調(diào)控具有重要的作用[30]。本研究首次克隆了AsCHS1的啟動(dòng)子,通過(guò)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件分析可知,該序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始位點(diǎn)-65 bp處,并且其上游-25~-30 bp區(qū)域存在TATA-box等典型的真核生物啟動(dòng)子核心元件,同時(shí)含有一些順式作用元件如赤霉素應(yīng)答元件。本研究發(fā)現(xiàn)ABA對(duì)AsCHS1啟動(dòng)子活性有增強(qiáng)功能,ET(乙烯)對(duì)該啟動(dòng)子活性有抑制功能,這與啟動(dòng)子功能元件預(yù)測(cè)結(jié)果不同,原因在于預(yù)測(cè)的結(jié)果是通過(guò)模式植物中已知的順式作用元件推斷的,但同種響應(yīng)元件可能有多種不同的堿基序列,這些非特異的序列并未挖掘完全。
此外,查爾酮合成酶是苯丙氨酸代謝途徑中重要的限速酶,控制著植物中黃酮類物質(zhì)和花青素的合成,其在白木香中的表達(dá)情況可能會(huì)對(duì)沉香的形成及品質(zhì)造成影響。激素處理對(duì)植物體內(nèi)黃酮類物質(zhì)的累積具有促進(jìn)效應(yīng),郭磊等[31]發(fā)現(xiàn)使用ABA處理桃果實(shí)后顯著促進(jìn)了查爾酮合成酶基因(CHS)的轉(zhuǎn)錄水平,促進(jìn)花色素苷的合成,從而促進(jìn)了桃果實(shí)的著色。田曉艷等[32]也發(fā)現(xiàn)脫落酸對(duì)南果梨的色素累積起作用。而關(guān)于ET對(duì)查爾酮合成酶表達(dá)的影響則很少有報(bào)道,乙烯對(duì)果實(shí)著色的促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在花青素合成代謝途徑的支路上[33-34]。因此本研究為通過(guò)激素處理來(lái)提高白木香中黃酮的含量提供了參考依據(jù)。
通過(guò)改變植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來(lái)提高次生代謝物的產(chǎn)量已有報(bào)道[35-36],如在青蒿中過(guò)量表達(dá)法尼基焦磷酸合成酶基因,青蒿素的含量與對(duì)照相比提高了4倍[37-38];健康的白木香植株并不產(chǎn)生沉香,只有通過(guò)自然因素(雷劈、火燒、蟲蛀等)或人為因素(砍傷、打洞、接菌等)的作用,沉香才會(huì)在植物中逐漸積累形成。通過(guò)對(duì)白木香AsCHS1啟動(dòng)子激素元件的深入研究,將通過(guò)激素刺激等直接或間接提高AsCHS1的表達(dá),從而摸索出能夠產(chǎn)生更多類型豐富的黃酮類次生代謝產(chǎn)物的方法,為探索白木香中黃酮類物質(zhì)產(chǎn)生和累積的原理提供依據(jù)。同時(shí),在啟動(dòng)子水平上,挖掘逆境下白木香查爾酮合成酶參與防御反應(yīng)的高表達(dá)機(jī)理,可為闡明白木香莖干部位細(xì)胞響應(yīng)傷害脅迫和黃酮類物質(zhì)累積的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
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