蔣續(xù)鋼，張 琳，廖 翔，張西峰

急性心肌梗死的發(fā)病率逐年升高，心肌壞死后引起的慢性心力衰竭越來越嚴(yán)重地威脅著人類的健康。干細(xì)胞移植實現(xiàn)心肌和血管的再生已成為心血管病學(xué)研究的熱點之一［1］。干細(xì)胞可以分化為具有心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，并且具備心肌功能［2，3］。但2007年實驗進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這種分化的心肌細(xì)胞具有壽命有限，傳代過程中存在老化，細(xì)胞體積增大，形態(tài)變得扁平，SAβ-半乳糖苷酶活性增加，干細(xì)胞樣特征丟失等現(xiàn)象，這種衰老使得實驗受阻［4-6］。成功構(gòu)建P16慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入干細(xì)胞，揭示干細(xì)胞分化衰老，為實現(xiàn)永生化心肌細(xì)胞提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 重組慢病毒p LVX-p16ink4a載體的構(gòu)建 質(zhì)粒p LVXZsGreen、p LVX-MCS和克隆質(zhì)粒pINCY-p16INK4a（Clontech公司）經(jīng)EcoRI＋Bam HI雙酶切，利用 Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit（Takara公司）分別回收質(zhì)粒p LVX-Zs-Green、p LVX-MCS經(jīng)酶切后大片段和質(zhì)粒pINCY-P16INK4A經(jīng)酶切后小片段。連接質(zhì)粒p LVX-ZsGreen、p LVX-MCS回收的大片段與pINCY-p16ink4a克隆質(zhì)粒回收的小片段，隨后取10 μL過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞。12 h后挑取（4～6）個單菌落接種于含100μg／m L Ampicillin抗性的5 m L LB培養(yǎng)液中，210 r／min，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h。用小量質(zhì)粒抽提試劑盒（碧云天公司）抽提質(zhì)粒，EcoRI＋Bam HI做酶切鑒定及測序鑒定。測序引物為CMV-F：5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對分析，完全與合成的基因序列P16INK4a相符。隨后用大規(guī)模質(zhì)粒抽提試劑盒（碧云天公司）提取質(zhì)粒p LVX-p16ink4a-ZsGreen和p LVXp16ink4a并純化。隨后利用ViraPowerTM慢病毒包裝系統(tǒng)（Invitrogen公司），進(jìn)行慢病毒載體p LVX-p16ink4a-ZsGreen，p LVX-P16INK4a、p LVX-MCS的包裝并收集。

1.2 目標(biāo)細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 六孔板內(nèi)的人成肌細(xì)胞（Scien Cell公司）在細(xì)胞融合70%左右時，更換無血清的人骨骼肌成肌細(xì)胞培養(yǎng)基，隨后將細(xì)胞分成兩組，實驗組轉(zhuǎn)導(dǎo)p LVXP16INK4a，空載體對照組轉(zhuǎn)導(dǎo)空載體pLVX-MCS。根據(jù)pLVXp16ink4a-ZsGreen轉(zhuǎn)染濃度決定MOI值。24 h后更換帶胎牛血清的人骨骼肌成肌細(xì)胞完全培養(yǎng)基（Scien Cell公司）。

1.3 轉(zhuǎn)導(dǎo)后目標(biāo)細(xì)胞的衰老檢測 目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)染36 h，72 h，108 h后，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS，加入1 m Lβ-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min后吸除細(xì)胞固定液，再經(jīng)PBS洗滌2次后每孔加入1 m L染色工作液。37℃孵育12 h，倒置像差顯微鏡下觀察。

1.4 轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞后P16蛋白表達(dá)檢測 分別在轉(zhuǎn)染后24 h，36 h，48 h，72 h，108 h對兩組細(xì)胞進(jìn)行P16INK4a蛋白的 Western blotting檢測。提取不同時間點各組細(xì)胞蛋白，利用RC DC Protein Assay Kit II（Bio Rad公司）測定蛋白濃度。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。半干轉(zhuǎn)印蛋白到PVDF膜，分別采用鼠抗人P16INK4a抗體（1∶1 000）（BD公司）4℃孵育過夜。而后用1：2 000的兔抗鼠的過氧化物酶2抗室溫孵育，用TBST洗滌，經(jīng)ECL發(fā)光試劑盒（BestBio公司，中國）顯定影。內(nèi)參用鼠抗人的β-Actin單克隆抗體。

2 結(jié) 果

2.1 病毒滴疫檢測 構(gòu)建P16慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)293FT細(xì)胞后，可見大量的綠色熒光，測量其滴度高達(dá)3.2×109TU／m L。詳見圖1。

圖1 p16慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)293FT細(xì)胞

2.2 轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞陽性率變化 利用倒置熒光顯微鏡觀察慢病毒p LVX-p16ink4a-ZsGreen載體轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)干細(xì)胞36 h，72 h，108 h熒光蛋白表達(dá)情況?？梢杂^察到P16載體免疫熒光蛋白36 h后開始表達(dá)，隨著細(xì)胞培養(yǎng)增殖傳代細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，但表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)陽性細(xì)胞比例下降。隨著細(xì)胞傳代108 h后，陽性轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞比例下降更為明顯。

2.3 轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞衰老變化 利用倒置熒光顯微鏡觀察慢病毒p LVX-P16INK4a轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞36 h，72 h，108 h后β-半乳糖苷酶染色情況，可以發(fā)現(xiàn)隨著目標(biāo)細(xì)胞傳代培養(yǎng)，72 h較36 h培養(yǎng)細(xì)胞的藍(lán)染物質(zhì)明顯增多，但隨著細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，可以觀察到108 h后細(xì)胞內(nèi)藍(lán)染物質(zhì)較72 h后明顯減少。

2.4 轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞P16蛋白表達(dá)變化 Western blotting 結(jié)果顯示，慢病毒p LVX-P16INK4a轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞36 h后P16蛋白開始表達(dá)，72 h后P16蛋白表達(dá)最多，并隨著細(xì)胞傳代增殖培養(yǎng)，P16蛋白表達(dá)逐漸減少（見圖2）。慢病毒p LVX-MCS轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞后各時間點均無P16表達(dá)。

圖2 慢病毒p LVX-P16INK4a組western blotting各時間點P16蛋白表達(dá)變化情況

3 討 論

P16INK4a蛋白屬細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白家族（CDKIs）中的一種，p16INK4a蛋白表達(dá)增多，與細(xì)胞周期蛋白D（cyclinD）結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4／6（cyclin-dependent kinase，CDK4／6），誘導(dǎo) Rb（retinoblastoma protein，Rb）蛋白保持非磷酸化，而非磷酸化的Rb蛋白抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F家族相關(guān)基因，將細(xì)胞周期 阻 斷 在 G1／S期［7］。大 量 研 究指出，p16INK4a蛋白表達(dá)增多，引發(fā)p16INK4a／cyclinD／p Rb／E2F信號通路的上調(diào)，是導(dǎo)致許多細(xì)胞衰老的一個重要原因［8-10］。在人類纖維母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，P16的表達(dá)升高并不與端粒縮短相關(guān)。與復(fù)制衰老過程中P21的上升不同的是，P16表達(dá)是細(xì)胞在培養(yǎng)過程中發(fā)生老化后上升的［11］。此外，P16還可以通過Ras誘導(dǎo)細(xì)胞的過早老化。許多實驗表明［12-17］，細(xì)胞衰老存在兩條途徑，非端粒酶縮短引起的復(fù)制衰老和p16-p Rb信號通路參與的應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。由于細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中兩種衰老途徑都可獨立完成，所以要阻止細(xì)胞衰老須同時阻斷這兩條信號通路。用siRNA敲除p16INK4a可以使細(xì)胞不再老化并可誘導(dǎo)細(xì)胞增生［18］。慢病毒載體可以有效感染并整合到非分裂細(xì)胞中，并且其整合性及免疫原性低等優(yōu)點。目前用的三代慢病毒載體，具有所謂的“自滅活”（self-inactivation，SIN），即該病毒基因組整合到細(xì)胞基因組后，不會產(chǎn)生新的子代病毒，也降低了對周圍基因的意外激活，因此具有較好的安全性。成功利用慢病毒載體攜帶P16目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)干細(xì)胞，為接下敲出衰老細(xì)胞P16基因提供實驗基礎(chǔ)。為利用干細(xì)胞移植培養(yǎng)永生化心肌細(xì)胞邁出了第一步。

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