楊雀飛，何彪，譚貴海

(高州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東 高州525200)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種好發(fā)于鼻咽部頭頸的惡性腫瘤，在我國南方最為常見，其發(fā)病率約為30～50/10萬[1]。有大量研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)鼻咽癌患者癌細(xì)胞中均存在EB(Epstein-Barr virus，EBV)病毒，在鼻咽癌患者外周血淋巴細(xì)胞中可以檢測到游離的EB病毒DNA，說明鼻咽癌的發(fā)病與EB病毒感染和發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)[2，3]。近年應(yīng)用分子雜交及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測亦證實(shí)EB病毒在鼻咽癌發(fā)展中的重要作用[4，5]。EB病毒DNA載量與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展有什么樣的聯(lián)系一直以來是人們所關(guān)注和研究的課題之一，本文定量檢測鼻咽癌患者外周血淋巴細(xì)胞中EB病毒DNA載量，為鼻咽癌患者臨床分期提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2013年1月我院腫瘤科收治住院的87例鼻咽癌患者，全部患者均經(jīng)病理活檢確診為鼻咽癌。其中男性49例，女性38例；年齡26~82歲，平均年齡54歲。依據(jù)92福州分期標(biāo)準(zhǔn) (1992年在福州召開的全國腫瘤與放射學(xué)術(shù)會議)進(jìn)行分期，其中Ⅰ期23例(26.4%)、Ⅱ期 18 例(20.7%)、Ⅲ期 26 例(29.9%)和Ⅳ期20例(23.0%)。

1.2 儀器與試劑 5個由低濃度到高濃度的EB病毒DNA陽性細(xì)胞株作為標(biāo)準(zhǔn)品均購買于中南大學(xué)腫瘤研究所，實(shí)時熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品，PCR相關(guān)試劑及淋巴細(xì)胞分離液購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.3 標(biāo)本處理 首先，采集87例患者外周血標(biāo)本2mL存于EDTA-Na2抗凝管中，然后，在無菌的塑料離心管中加入2ml淋巴細(xì)胞分離液，將血液進(jìn)行1:1稀釋后緩慢把混勻的血樣PBS混合液加入到有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，1500r/min，15min，進(jìn)行離心。用長嘴膠頭滴管吸取分離液層中的淋巴細(xì)胞(第二層)，把吸取的淋巴細(xì)胞溶液裝入另一無菌離心管中加入5ml PBS洗滌，1500r/min,經(jīng)離心10min后，去掉上層液體，保留離心管底的若干白色物質(zhì)，即淋巴細(xì)胞；再加入等體積Tris-EDTA裂解液和蛋白酶K，37℃水浴1 h，高速離心后取上清，經(jīng)酚-氯仿抽提，乙醇沉淀清洗得到DNA模板[6]，以 EB病毒DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增檢測。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對淋巴細(xì)胞中EB病毒游離DNA進(jìn)行定量測定。反應(yīng)條件為 93℃ 3min，93℃ 45s， 55℃ 2min， 共 40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用計算機(jī)將樣本和標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算出反應(yīng)體系中待測標(biāo)本中DNA的拷貝數(shù)。PCR反應(yīng)總體積為50μl，含l0μl PCR緩沖液，引物和對應(yīng)的熒光標(biāo)記探針各 10pmol。dATP、dCTP、dGTP 和 dUTP 各 200 μmol／L，Tap 聚合酶5U，DNA 模板 5μl， 吸取抽提的 DNA 5μl入 PCR的反應(yīng)管中，在ABI7300自動熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。陽性標(biāo)準(zhǔn)定義為：DNA水平>1×103拷貝/m l判斷為陽性；陰性標(biāo)準(zhǔn)定義為：DNA≤1×103拷貝/ml判斷為陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。計量資料采用 x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌患者外周血淋巴細(xì)胞中EB病毒DNA檢測 以EB病毒DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，計算不同患者外周血淋巴細(xì)胞中EB病毒DNA的拷貝數(shù)及中位數(shù)。結(jié)果顯示，鼻咽癌患者淋巴細(xì)胞中EB病毒DNA的陽性率為82.76%(72/87)，中位數(shù)為7.58×106拷貝數(shù)/ml，經(jīng) χ2檢驗(yàn)分析，不同臨床分期鼻咽癌患者中EB病毒DNA定量測定比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，結(jié)果見表1。

2.2 不同分期鼻咽癌患者EB病毒的含量有明顯差異 87例鼻咽癌患者檢測EB病毒DNA載量中，Ⅰ期23例、Ⅱ期18例、Ⅲ期26例、Ⅳ期20例的鼻咽癌患者DNA拷貝數(shù)平均數(shù)分別為 (4.25±1.14)×103，(4.56±0.68)×104，(7.88±1.65)×105，(8.09±1.65)×106。 對不同組間進(jìn)行 t檢驗(yàn)，P<0.05或 P<0.01結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異，結(jié)果見表2。

表1 不同臨床分期鼻咽癌患者中EB病毒DNA定量測定比較

表2 鼻咽癌患者DNA拷貝數(shù)

3 討論

鼻咽癌是一種與EB病毒非常密切的惡性腫瘤，有學(xué)者認(rèn)為在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中，EB病毒感染淋巴細(xì)胞是感染及致病的重要機(jī)制[7]。而在目前臨床應(yīng)用廣泛的EB病毒血清標(biāo)志物檢測指標(biāo)中，EB病毒DNA定量測定應(yīng)用對鼻咽癌的診斷及預(yù)后的預(yù)測有著很大的優(yōu)勢[8，9]。本文資料顯示，采用實(shí)時熒光定量PCR法對我院87例鼻咽癌患者外周血淋巴細(xì)胞EB病毒DNA含量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者的陽性率為82.76%(72/87)，說明外周血淋巴細(xì)胞中EB病毒檢測在鼻咽癌輔助診斷中具有極高價值。然而，有研究分析[10]EB病毒感染鼻咽組織是普遍現(xiàn)象，且感染發(fā)生在癌變前，由于EBV存在F和f兩種亞型，故檢出陽性率不可能達(dá)到100%。

鼻咽癌臨床分期指導(dǎo)下的個體化綜合治療已成為腫瘤治療的規(guī)范。鼻咽癌治療療效在一定程度上決定于鼻咽癌所處臨床分期，Ⅰ-Ⅳ期5年生存率分別為92.38%、79.64%、62.31%和40.16%，鼻咽癌的臨床分期在鼻咽癌治療中起重要作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者淋巴細(xì)胞中存在大量游離的EB病毒DNA，并發(fā)現(xiàn)EB病毒DNA隨著腫瘤消長而變化，鼻咽癌患者EB病毒DNA檢測在鼻咽癌治療評價中的重要性已得到普遍認(rèn)可，然而外周血淋巴細(xì)胞中EB病毒DNA在初診鼻咽癌臨床分期中的作用仍不十分清楚。

為進(jìn)一步明確鼻咽癌患者外周血淋巴細(xì)胞中EB病毒DNA鼻咽癌患者臨床分期的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)對比分析了鼻咽癌患者EB病毒DNA與所處臨床分期的關(guān)系，以明確EB病毒DNA在鼻咽癌臨床分期中的價值。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測EB病毒DNA載量，分析外周血淋巴細(xì)胞中EB病毒DNA載量與鼻咽癌患者臨床分期關(guān)系。結(jié)果顯示EB病毒DNA載量與鼻咽癌臨床分期密切相關(guān)，即隨Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分期的遞增，EB病毒DNA拷貝數(shù)越高，這與相關(guān)報道相同[12]。Ⅲ、Ⅳ期EB病毒DNA拷貝數(shù)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期的，即臨床分期越晚，患者淋巴細(xì)胞中EB病毒DNA載量越高,外周血淋巴細(xì)胞中EB病毒游離DNA拷貝數(shù)與鼻咽癌分期相一致，很好地反映了鼻咽癌臨床特征，EB游離DNA拷貝數(shù)與患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)，提示EB病毒DNA載量與鼻咽癌病情進(jìn)展密切相關(guān)，可作為病情監(jiān)測及判斷療效的一種有效手段。

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