丹 彤， 黃文強(qiáng)， 白 雪， 邢萬金

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 哺乳動物生殖生物學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室, 呼和浩特 010021)

哺乳動物的授精過程由精子成熟、獲能、精卵結(jié)合與融合等一系列事件組成，是個復(fù)雜而又有序的事件，涉及精子和卵子上的很多特異性蛋白和脂質(zhì)分子。在眾多與精卵黏附和融合有關(guān)的蛋白分子中，研究較多的是精子表面的蛋白，如IZUMO家族中的IZUMO1蛋白、ADAMs(a disintegrin and metalloprotease)家族中的受精素和Cyritestin、PDI(Protein disulfide isomerase)家族中的PDIA3 (ERP57)、CRISPs(cysteine-rich secretory proteins)家族蛋白、SPESP1(Sperm equatorial segment protein 1)、Equatorin、TMEM190 (Transmembrane protein 190)、SPACA (Sperm acrosome associated)家族的SPACA3 (SLLP1)、TSSK6(testis-specific serine/threonine kinase 6)等10多種[1]。其中CRISPs家族蛋白最初發(fā)現(xiàn)于一些嚙齒動物的雄性生殖道組織中，后來在其它哺乳動物、七鰓鰻、非洲爪蟾和毒蛇等脊椎動物中均發(fā)現(xiàn)，是一類在進(jìn)化上比較保守的分泌蛋白，其成員的氨基酸序列也高度同源。CRISP1、CRISP2均發(fā)現(xiàn)能與卵子表面直接結(jié)合，并影響精卵融合，是一類對于哺乳動物生殖極為重要的分泌蛋白。本實驗室近年來克隆并研究了羊、牛CRISP家族成員的cDNA及其與其它精卵融合相關(guān)蛋白相互作用，取得了若干原創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)。本文將從CRISP家族蛋白的結(jié)構(gòu)與功能組織分布與行為特性，來闡述該家族蛋白在精子成熟、獲能、精卵結(jié)合與融合等不同事件上所扮演的重要角色和可能的分子作用機(jī)制。

1 CRISPs家族蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

CRISPs家族蛋白成員最顯著的特點是富含半胱氨酸，其中有16個半胱氨酸殘基位置高度保守 (圖1)。根據(jù)其氨基酸序列同源性和組織分布特性，哺乳動物的CRISPs蛋白可以被分為4個亞類，分別是CRISP1、CRISP2、CRISP3和CRISP4[2-4]，這幾類蛋白均已證明在精子成熟、獲能以及精卵結(jié)合與融合過程中具有重要作用[4， 5]。

CRISPs家族蛋白是CAP蛋白超家族(CRISPs,Antigen 5 proteins, Pathogenesis-related proteins)中的一部分，在其蛋白N端具有大約160個氨基酸的高度保守的CAP結(jié)構(gòu)域,是該超家族蛋白共有的結(jié)構(gòu)域，C端有一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD，cysteine rich domain)，稱為CRISP結(jié)構(gòu)域，是CRISPs家族特有的結(jié)構(gòu)[6-8]。 CAP結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和氨基酸序列與植物中與病原體侵襲響應(yīng)機(jī)制有關(guān)且具有殺菌能力的發(fā)病機(jī)制相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins)類似，因而也被稱為PR-1(pathogenesis-related proteins of group 1)結(jié)構(gòu)域。在這個結(jié)構(gòu)域中有6個保守的半胱氨酸殘基，形成3個二硫鍵，對維持CAP結(jié)構(gòu)域獨特的類似α-β-α的折疊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有重要作用[7， 9]。 在大鼠的CRISP1蛋白的CAP結(jié)構(gòu)域中存在著兩個進(jìn)化上保守的基序S1(signature 1)與S2(signature 2)。人工氨基酸缺失突變研究表明由12個氨基酸構(gòu)成的S2基序正是CRISP1蛋白與卵子表面結(jié)合的位點[10](圖2)。多數(shù)CAP超家族蛋白都在CAP結(jié)構(gòu)域的N端有一段典型的信號肽序列，因此屬分泌蛋白，可能通過諸如離子通道閘門或激活細(xì)胞表面受體之類的途徑參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)，也有可能修飾其它蛋白，參與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑或細(xì)胞的粘附[9]。從織錦芋螺(Conus textile)毒液管里分離出的CRISP同源蛋白Tex31具有蛋白水解活性[11]，暗示PR-1結(jié)構(gòu)域可是蛋白酶的組成模塊，但是在以后的研究中并沒有發(fā)現(xiàn)其它CRISP蛋白具有酶活性。CRISP蛋白的CRISP結(jié)構(gòu)域由鉸鏈區(qū)(hinge region)和離子通道調(diào)節(jié)區(qū)(ICR，ion channel regulatory)組成(圖2)，鉸鏈區(qū)連接著N末端的CAP結(jié)構(gòu)域和C末端的ICR結(jié)構(gòu)域。鉸鏈區(qū)中包含4個保守的半胱氨酸殘基，形成2個二硫鍵，ICR區(qū)有6個保守半胱氨酸殘基，形成3個二硫鍵，如小鼠CRISP1(Uniprot Q03401):C190?C197、C193?C202、C206?C239、C215?C233、C224?C237；CRISP2(Uniprot P16563):C199?C196、C192?C201、C205?C238、C214?C232、C223?C236；CRISP3(Uniprot Q03402):C194?C201、C197?C206、C210?C241、C219?C235、C226?C239；這些交錯的二硫鍵對于該結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定和功能具有重要意義[12， 13]。CRISP結(jié)構(gòu)域內(nèi)的6個保守性半胱氨酸殘基間的二硫鍵使肽鏈折疊，形成了獨特的具有離子通道調(diào)節(jié)活性的溝壑結(jié)構(gòu)[8]，在爬行類和哺乳類中[14]，都具有離子通道調(diào)節(jié)活性，例如K+、Ca2+通道抑制性[7， 12]。生殖道中以及精子表面分布的CRISP蛋白也具有離子通道調(diào)節(jié)活性，而精子獲能依賴于環(huán)境中的離子濃度[15]，因此推測哺乳動物的CRISP蛋白可能與精子獲能有關(guān)。

2 CRISPs家族各成員的結(jié)構(gòu)與功能

2.1 附睪的CRISP1蛋白

CRISP1(DE， AEG)是最早在大鼠附睪中發(fā)現(xiàn)的一種雄性激素劑量依賴性分泌蛋白，附睪頭近端的上皮細(xì)胞合成并分泌CRISP1，精子在附睪中儲運(yùn)時，CRISP1蛋白黏附到精子頭部，定位于大鼠精子頭部背側(cè)區(qū)域。

附睪分泌的CRISP1既有全長氨基酸鏈的完整CRISP1，也有一部分被蛋白酶水解加工后形成兩種不同形式的CRISP1蛋白，第一種形式是蛋白D，分子量較大，約32 kDa，它是附睪中CRISP1的最主要的形式，以松散、可逆的方式同精子表面相結(jié)合，容易被離子溶液脫去；另一種形式是蛋白E，分子量較小，約22 kDa，同精子表面緊密結(jié)合[16]，推測這種形式的CRISP1蛋白可能是C末端的CRISP結(jié)構(gòu)域被剪掉的CRISP1蛋白剪接體[13]。CRISP1在精子上可能有其特殊的受體，當(dāng)精子離開睪丸進(jìn)入雌性生殖道后，D形式的CRISP1從精子表面釋放，而E形式的CRISP1仍結(jié)合于精子表面，并重新定位，遷移到精子頭部的赤道段區(qū)域[13]。鑒于這個區(qū)域正是精子頭部與卵子膜融合的起始區(qū)域，CRISP1可能還參與精卵融合過程[17]。原核表達(dá)的重組大鼠CRISP1能與卵子質(zhì)膜直接結(jié)合[10]，而且與卵結(jié)合的活性部位限定在PR-1結(jié)構(gòu)域范圍中的45個氨基酸區(qū)(114-158)，這個區(qū)域包含了兩個CRISP家族的特征基序，分別是S1(signature 1)和S2(signature 2)。實驗結(jié)果確定了大鼠CRISP1的S2區(qū)域與卵結(jié)合的關(guān)聯(lián)性[10]。但敲除CRISP1基因的小鼠并不影響生殖，只降低了精子穿過透明帶和與卵融合的能力[18]，可能是CRISP2補(bǔ)充了CRISP1的功能。目前還有待于進(jìn)行CRISP1和CRISP2雙敲除小鼠實驗，觀察CRISPs對精卵融合的影響。

CRISP2最初被命名為睪丸特異性蛋白1(testis-specific protein 1, Tpx-1)，特異性表達(dá)于睪丸及其精細(xì)胞上。人和小鼠的CRISP2蛋白是頂體內(nèi)部的蛋白，在頂體反應(yīng)后仍然留在精子上[19]。在小鼠配子共孵育時加入CRISP2多克隆抗體，導(dǎo)致精子進(jìn)入去透明帶卵的穿透率顯著下降，且呈劑量依賴效應(yīng)[19， 20]。CRISP2抗體也能顯著地降低精子穿透卵子透明帶的穿透率，但最引人注目的是穿過透明帶的精子積聚在卵周隙，說明抗體并未損害精子的能動性和頂體反應(yīng)，只是抑制精卵融合，即CRISP2在精卵融合階段起作用20。此外，原核表達(dá)的重組CRISP2能與去透明帶的人卵子結(jié)合[19]。原核表達(dá)的重組小鼠CRISP2同CRISP1一樣，在卵的成融區(qū)域具有結(jié)合位點，證實了卵表面存在這兩種蛋白的共同結(jié)合位點[20]。暗示在同源分子間存在著功能合作或冗余，以確保成功授精。本實驗室近年來發(fā)現(xiàn)羊CRISP2能夠與另一種精卵融合相關(guān)蛋白PDIA3相互結(jié)合(未發(fā)表)，暗示CRISP2在精子上參與精卵融合復(fù)合體的形成。

2.3 組織多樣性的CRISP3蛋白

CRISP3首先在小鼠和人體的唾液腺組織中被發(fā)現(xiàn)。CRISP3在唾液腺中的表達(dá)呈現(xiàn)比較強(qiáng)的雄性激素依賴性，在雌性唾液腺中也檢測到微弱的表達(dá)[21]。后來發(fā)現(xiàn)CRISP3也表達(dá)于小鼠的前B細(xì)胞、人的中性白細(xì)胞、胸腺、胰腺、淚腺、唾液腺、卵巢、前列腺等組織中[21]，具有組織多樣性。人CRISP3蛋白廣泛存在于外分泌腺體及免疫系統(tǒng)中，暗示CRISP3蛋白可能對病原體入侵等病理應(yīng)答方面具有免疫保護(hù)功能，CRISPs家族蛋白在N末端具有一個與植物致病相關(guān)蛋白類似的PR-1結(jié)構(gòu)域，也是對CRISP3可能參與免疫功能的支持。

人附睪中的CRISP3是由附睪上皮分泌細(xì)胞合成，在附睪尾腔和輸精管中濃度最高。精液中的CRISP3主要源自附睪下游的附屬生殖組織，如輸精管和前列腺[22]。目前尚無實驗確認(rèn)CRISP3在生殖過程中的作用，只推測可能與精子成熟有關(guān)，或者可能類似CRISP1那樣參與了配子融合時的相互作用[23-25]。

CRISP3 在人的正常前列腺中低水平表達(dá)，而在癌性的前列腺中超表達(dá)，顯示CRISP3可能與細(xì)胞癌變有關(guān)。因此可以將CRISP3作為一種檢測前列腺癌的生物標(biāo)記[25， 26]。但是CRISP3在其它癌組織中并不高表達(dá)，例如在慢性胰腺炎組織中雖然比在正常胰腺組織中表達(dá)水平高，但在胰腺癌細(xì)胞系中沒有檢測到表達(dá)，在其它癌性的胃腸道組織中表達(dá)也并不高[27]。盡管CRISP3在這些病理組織中的活性機(jī)制仍不清楚，但也暗示著CRISP3蛋白在生殖過程之外也扮演重要的角色。

2.4 附睪的CRISP4蛋白

CRISP4目前只發(fā)現(xiàn)于大鼠和小鼠的體內(nèi)，分布于在附睪的多個區(qū)域，在附睪體和附睪尾的含量最豐富，在這里向成熟的精子上粘附，與精子的成熟有關(guān)聯(lián)[2， 3， 28， 29]。除了在雄性生殖道中外，在卵母細(xì)胞、骨骼肌、脾臟、胸腺中也發(fā)現(xiàn)了低量表達(dá)的CRISP4蛋白[3， 30]。大鼠CRISP4和小鼠CRISP4間有91%的相似性，與人類的CRISP1同源，可能與人CRISP1有著功能相似性，作為抑能因子起作用[9]，但目前關(guān)于CRISP4的確鑿功能及在CRISP家族中的角色和地位尚沒有充足的研究。

3 展望

自從在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)CRISPs分泌蛋白以來，對CRISPs 家族的研究已經(jīng)取得了長足的進(jìn)展,積累了很多物種的CRISPs成員的cDNA序列、蛋白結(jié)構(gòu)等基本生物學(xué)與功能資料，尤其是它們在生殖過程中的作用。近年來發(fā)現(xiàn)CRISP1和CRISP2都能與卵子直接結(jié)合，引發(fā)了人們對其直接參與精卵結(jié)合和融合的關(guān)注和分離位于卵子表面的潛在結(jié)合配體的興趣。 由于CRISPs家族成員在氨基酸序列上的高度同源性和功能的相似性，人們認(rèn)為它們可能以功能互補(bǔ)形式共同參與精子與卵子結(jié)合，這給單獨研究某個成員的作用分子機(jī)制帶來了困難。未來的工作仍然需要進(jìn)一步敲除CRISP基因，包括同時敲除兩個CRISP基因來鑒定他們對應(yīng)的生殖作用。其次要揭示CRISPs與其它精卵融合相關(guān)蛋白之間的相互作用，從而推測它們在影響精卵融合的蛋白復(fù)合體或者相互作用鏈中所起的作用。

哺乳動物精卵融合的分子機(jī)制是個極為重要的生命科學(xué)基礎(chǔ)問題，但由于目前在技術(shù)上還不能在體外長期培養(yǎng)并誘導(dǎo)生殖母細(xì)胞產(chǎn)生配子，也不能培養(yǎng)哺乳動物的單倍體配子細(xì)胞，所以難以解析精子與卵子結(jié)合和融合的精細(xì)過程以及篩選影響這些關(guān)鍵過程的因子。未來的突破方向當(dāng)務(wù)之急是性母細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化的技術(shù)，其次是改變研究策略，改為研究已知的若干種精卵融合相關(guān)蛋白之間的相互作用，找出它們之間的作用方式，推測它們在精卵融合過程中的作用模式。

參考文獻(xiàn)：

[1]Evans J P. Sperm-egg interaction[J]. Annu Rev Physiol, 2012, 74: 477-502.

[2]Jalkanen J, Huhtaniemi I, Poutanen M. Mouse cysteine-rich secretory protein 4 (CRISP4): a member of the Crisp family exclusively expressed in the epididymis in an androgen-dependent manner[J]. Biol Reprod, 2005, 72(5): 1268-1274.

[3]Nolan M A, Wu L, Bang H J, et al. Identification of rat cysteine-rich secretory protein 4 (Crisp4) as the ortholog to human CRISP1 and mouse Crisp4[J]. Biol Reprod, 2006, 74(5): 984-991.

[4]Cohen D J, Maldera J A, Weigel Munoz M, et al. Cysteine-rich secretory proteins (CRISP) and their role in mammalian fertilization[J]. Biol Res, 2011, 44(2): 135-138.

[5]Koppers A J, Reddy T, O'Bryan M K. The role of cysteine-rich secretory proteins in male fertility[J]. Asian J Androl, 2011, 13(1): 111-117.

[6]Wang J, Shen B, Guo M, et al. Blocking effect and crystal structure of natrin toxin, a cysteine-rich secretory protein from Naja atra venom that targets the BKCa channel[J]. Biochemistry, 2005, 44(30): 10145-10152.

[7]Shikamoto Y, Suto K, Yamazaki Y, et al. Crystal structure of a CRISP family Ca2+-channel blocker derived from snake venom[J]. Journal of Molecular Biology, 2005, 350(4): 735-743.

[8]Guo M, Teng M, Niu L, et al. Crystal structure of the cysteine-rich secretory protein stecrisp reveals that the cysteine-rich domain has a K+channel inhibitor-like fold[J]. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(13): 12405-12412.

[9]Gibbs G M, Roelants K, O'Bryan M K. The CAP superfamily: cysteine-rich secretory proteins, antigen 5, and pathogenesis-related 1 proteins-roles in reproduction, cancer, and immune defense[J]. Endocrine Reviews, 2008, 29(7): 865-897.

[10]Ellerman D A, Cohen D J, Da Ros V G, et al. Sperm protein "DE" mediates gamete fusion through an evolutionarily conserved site of the CRISP family[J]. Dev Biol, 2006, 297(1): 228-237.

[11]Milne T J, Abbenante G, Tyndall J D, et al. Isolation and characterization of a cone snail protease with homology to CRISP proteins of the pathogenesis-related protein superfamily[J]. J Biol Chem, 2003, 278(33): 31105-31110.

[12]Gibbs G M, Scanlon M J, Swarbrick J, et al. The cysteine-rich secretory protein domain of Tpx-1 is related to ion channel toxins and regulates ryanodine receptor Ca2+signaling[J]. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(7): 4156-4163.

[13]Roberts K P, Johnston D S, Nolan M A, et al. Structure and function of epididymal protein cysteine-rich secretory protein-1[J]. Asian Journal of Andrology, 2007, 9(4): 508-514.

[14]Sunagar K, Johnson W E, O′Brien S J, et al. Evolution of CRISPs associated with toxicoferan-reptilian venom and mammalian reproduction[J]. Mol Biol Evol, 2012, 29(7): 1807-1822.

[15]Visconti P E, Westbrook V A, Chertihin O, et al. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity[J]. J Reprod Immunol, 2002, 53(1/2): 133-150.

[16]Cohen D J, Rochwerger L, Ellerman D A, et al. Relationship between the association of rat epididymal protein "DE" with spermatozoa and the behavior and function of the protein[J]. Molecular Reproduction and Development, 2000, 56(2): 180-188.

[17]Legare C, Cloutier F, Makosso-Kallyth S, et al. Cysteine-rich secretory protein 1 in seminal plasma: potential biomarker for the distinction between obstructive and nonobstructive azoospermia[J]. Fertil Steril, 2013, 100(5): 1253-1260.

[18]Da Ros V G, Maldera J A, Willis W D, et al. Impaired sperm fertilizing ability in mice lacking cysteine-rich secretory protein 1 (CRISP1) [J]. Dev Biol, 2008, 320(1): 12-18.

[19]Cohen D J, Busso D, Da Ros V, et al. Participation of cysteine-rich secretory proteins (CRISP) in mammalian sperm-egg interaction[J]. Int J Dev Biol, 2008, 52: 737-742.

[20]Busso D, Goldweic N M, Hayashi M, et al. Evidence for the involvement of testicular protein CRISP2 in mouse sperm-egg fusion[J]. Biology of Reproduction, 2007, 76(4): 701-708.

[21]Haendler B, Kratzschmar J, Theuring F, et al. Transcripts for cysteine-rich secretory protein-1 (CRISP-1; DE/AEG) and the novel related CRISP-3 are expressed under androgen control in the mouse salivary gland[J]. Endocrinology, 1993, 133(1): 192-198.

[22]Udby L, Bjartell A, Malm J, et al. Characterization and localization of cysteine-rich secretory protein 3 (CRISP-3) in the human male reproductive tract[J]. Journal of Andrology, 2005, 26(3): 333-342.

[23]Hoogland A M, Dahlman A, Vissers K J, et al. Cysteine-rich secretory protein 3 and beta-microseminoprotein on prostate cancer needle biopsies do not have predictive value for subsequent prostatectomy outcome[J]. BJU Int, 2011, 108(8): 1356-1362.

[24]Ribeiro F R, Paulo P, Costa V L, et al. Cysteine-rich secretory protein-3 (CRISP3) is strongly up-regulated in prostate carcinomas with the TMPRSS2-ERG fusion gene[J]. PLoS One, 2011, 6(7): e22317.

[25]Grupp K, Kohl S, Sirma H, et al. Cysteine-rich secretory protein 3 overexpression is linked to a subset of PTEN-deleted ERG fusion-positive prostate cancers with early biochemical recurrence[J]. Mod Pathol, 2013, 26(5): 733-742.

[26]Kosari F, Asmann Y W, Cheville J C, et al. Cysteine-rich secretory protein-3: a potential biomarker for prostate cancer[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2002, 11(11): 1419-1426.

[27]Liao Q, Kleeff J, Xiao Y, et al. Preferential expression of cystein-rich secretory protein-3 (CRISP-3) in chronic pancreatitis[J]. Histol Histopathol, 2003, 18(2): 425-433.

[28]Gibbs G M, Orta G, Reddy T, et al. Cysteine-rich secretory protein 4 is an inhibitor of transient receptor potential M8 with a role in establishing sperm function[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(17): 7034-7039.

[29]Turunen H T, Sipila P, Krutskikh A, et al. Loss of cysteine-rich secretory protein 4 (Crisp4) leads to deficiency in sperm-zona pellucida interaction in mice[J]. Biol Reprod, 2012, 86(1): 1-8.

[30]Reddy T, Gibbs G M, Merriner D J, et al. Cysteine-rich secretory proteins are not exclusively expressed in the male reproductive tract[J]. Dev Dyn, 2008, 237(11): 3313-3323.