王延藏，張瓊敏，朱翌

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

年齡與線粒體DNA A1555G突變所致的聽(tīng)力損失關(guān)系的研究

王延藏1，張瓊敏2，朱翌2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325015）

目的：分析線粒體DNA A1555G突變致聾的患者其發(fā)病年齡及病程長(zhǎng)短與聽(tīng)力損失是否有相關(guān)性，為臨床上預(yù)測(cè)其病情發(fā)展提供依據(jù)。方法：將154例線粒體DNA A1555G突變致聾的患者，按其發(fā)病年齡分為三組（≤1歲，＞1歲且≤3歲，＞3歲），分別對(duì)各組耳聾患者的聽(tīng)力損失程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；將156例患者按其病程長(zhǎng)短分為三組（≤10年，＞10年且≤20年，＞20年），分別對(duì)各組耳聾患者的聽(tīng)力損失程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：發(fā)病年齡≤1歲和＞1歲且≤3歲的患者，其聽(tīng)力損失為極重度的所占比例較高（分別為85.7%和72.2%）（P=0.000）；病程長(zhǎng)短為＞10年且≤20年及＞20年的患者，其聽(tīng)力損失為極重度的所占比例較高（分別為74.1%和70.3%）（P=0.000）。結(jié)論：線粒體DNA A1555G突變致聾的患者，其聽(tīng)力損失與發(fā)病年齡、病程長(zhǎng)短有關(guān)，發(fā)病越早，病程越長(zhǎng)，其聽(tīng)力損失越重，發(fā)病越晚，病程越短，其聽(tīng)力損失越輕。

聽(tīng)力損失；線粒體；A1555G基因突變；年齡

耳聾是人類的常見(jiàn)疾病之一，給語(yǔ)言學(xué)習(xí)及交流帶來(lái)障礙，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量。遺傳因素和環(huán)境因素均可引起耳聾，研究發(fā)現(xiàn)每1 000個(gè)新生兒中就有1個(gè)是耳聾患兒，而其中約有一半患兒的耳聾是由遺傳因素引起的[1]。在一些國(guó)家，線粒體DNA突變是導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾的重要原因之一，而這些突變多數(shù)發(fā)生在線粒體12S rRNA和tRNA基因上[2-3]。A1555G突變是線粒體12S rRNA基因上最常見(jiàn)的致聾相關(guān)突變，然而攜帶該突變者聽(tīng)力可表現(xiàn)為正常以及不同程度的損失。研究表明，氨基糖甙類藥物、核修飾基因及線粒體單體型等與線粒體A1555G突變所致聽(tīng)力損失有關(guān)[4-6]，那么年齡是否也與其有關(guān)？隨著年齡的增長(zhǎng)，線粒體A1555G突變所致的聽(tīng)力損失是否也隨之改變？為此，我們對(duì)線粒體A1555G突變所致耳聾患者的聽(tīng)力損失程度及年齡進(jìn)行了相關(guān)性研究。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象自2005年7月至2013年6月間在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科確診為除外合并有急性或慢性中耳炎、晚期梅尼埃病、聽(tīng)神經(jīng)瘤、腦膜腦炎、藥物、外傷等有明確原因致聾的耳聾，并在浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)出攜帶有線粒體A1555G突變的耳聾患者。經(jīng)篩選共有156例符合要求，其中男76例，女80例，年齡7～68歲，平均26.4歲。以上受檢者在檢查前均按照溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)管理規(guī)定簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 線粒體全基因組突變分析：采集患者靜脈外周血，使用Universial DNA分離試劑盒[購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司]提取血液基因組DNA，以此為模板PCR擴(kuò)增含有整個(gè)線粒體12S rRNA基因片段，引物位于mtDNA 618-635（正向）和1988-2007（正向）[7]。在PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后，用BigDye末端循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試劑盒在ABI 3700 DNA自動(dòng)測(cè)序儀上直接測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與經(jīng)過(guò)校正的劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列（GenBank：NC_001807）進(jìn)行比對(duì)[8]。

1.2.2 純音測(cè)聽(tīng)：采用經(jīng)零級(jí)校正的丹麥Madsen Voyager 502型聽(tīng)力計(jì)，在本地噪聲低于25 dB的測(cè)聽(tīng)室內(nèi)，按照標(biāo)準(zhǔn)純音測(cè)聽(tīng)步驟對(duì)受試者進(jìn)行聽(tīng)力測(cè)試。使用退10進(jìn)5的方法，每個(gè)頻率重復(fù)3次，其中有2次剛好能聽(tīng)到測(cè)試聲處所對(duì)應(yīng)的聲音強(qiáng)度即為該頻率聽(tīng)閾。PTA采用WHO-1997標(biāo)準(zhǔn)，以500 Hz、1 000 Hz、2 000 Hz和4 000 Hz的平均聽(tīng)閾為準(zhǔn)，聽(tīng)力損失26～40 dB為輕度聾，41～60 dB、61～80 dB和＞81 dB依次為中度聾、重度聾和極重度聾。氣導(dǎo)聽(tīng)閾≤25認(rèn)為其聽(tīng)力正常。雙側(cè)耳聾的聽(tīng)力損失程度不同時(shí)，以聽(tīng)力損失較輕的一側(cè)為準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法使用PASW Statistics 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，利用卡方檢驗(yàn)分別對(duì)線粒體A1555G突變耳聾患者的聽(tīng)力損失程度在不同發(fā)病年齡及病史時(shí)間組中的構(gòu)成比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

將154例線粒體A1555G突變致聾的患者按其發(fā)病年齡分為三組（≤1歲，＞1歲且≤3歲，＞3歲），分別對(duì)各組耳聾患者的聽(tīng)力損失程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（見(jiàn)表1）。其中，發(fā)病年齡是患者及其家人發(fā)覺(jué)其耳聾，并行客觀聽(tīng)力學(xué)檢查確診為耳聾，或某些輕度聽(tīng)力損失患者主觀上未感覺(jué)聽(tīng)力損失，但患者接受客觀聽(tīng)力學(xué)檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)耳聾的時(shí)間。

表1 發(fā)病年齡對(duì)聽(tīng)力損失程度的影響 [n（%）]

如表1顯示，在線粒體A1555G突變致聾的患者中，大部分患者的聽(tīng)力損失程度為極重度（占59.7%），0～3歲發(fā)病的患者，極重度耳聾所占比例高于72.2%。由表1我們可以看出，不同發(fā)病年齡段的聽(tīng)力損失程度的構(gòu)成比不同，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=48.195，P=0.000），因此，對(duì)于線粒體A1555G突變致聾的患者，其發(fā)病年齡與聽(tīng)力損失程度具有相關(guān)性，發(fā)病年齡越小，其聽(tīng)力損失程度越重。

經(jīng)過(guò)篩查，所研究的耳聾患者中，有病程時(shí)間及聽(tīng)力損失程度的共有156例，我們將這156例耳聾患者按其病程長(zhǎng)短分為下列三組：≤10年，＞10年且≤20年，＞20年，然后分別對(duì)各組耳聾患者的聽(tīng)力損失程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（見(jiàn)表2）。其中，病程是首次客觀聽(tīng)力學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)患者耳聾至本研究中進(jìn)行聽(tīng)力學(xué)檢查的時(shí)間。

如表2所示，病程有10年以上的，其聽(tīng)力損失程度以極重度占多數(shù)（所占比例高于70.3%），其次依次為重度、中度、輕度聽(tīng)力損失。不同病程組中，其聽(tīng)力損失程度的構(gòu)成比不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=40.468，P=0.000），所以我們可得知線粒體A1555G突變致聾的患者，其病程長(zhǎng)短與聽(tīng)力損失程度有相關(guān)性，病史越長(zhǎng)，其聽(tīng)力損失程度越重，因此線粒體A1555G突變所致的聽(tīng)力損失是呈漸進(jìn)性的。

表2 病程對(duì)聽(tīng)力損失程度的影響 [n（%）]

3 討論

A1555G突變是線粒體12S rRNA基因上最常見(jiàn)的致聾相關(guān)突變，可導(dǎo)致線粒體蛋白質(zhì)合成異常并隨之引起細(xì)胞的呼吸功能異常，進(jìn)一步引發(fā)耳聾。然而攜帶A1555G突變的個(gè)體其聽(tīng)力變化范圍較大，有些表現(xiàn)為正常，有些則表現(xiàn)為從輕度到極重度的聽(tīng)力損失，這表明線粒體A1555G突變本身并不足以引發(fā)耳聾，還有其他一些因素影響其致病性。在以往的研究中，發(fā)現(xiàn)氨基糖甙類藥物會(huì)導(dǎo)致或加重?cái)y帶線粒體A1555G突變個(gè)體的聽(tīng)力損失[9]；呂建新等[10]發(fā)現(xiàn)在線粒體A1555G突變致聾的患者中，線粒體單體型D所占比例最高，同時(shí)也高于正常人群對(duì)照組，而線粒體單體型是B的耳聾患者其家族耳聾外顯率相對(duì)較高，且聽(tīng)力損失相對(duì)也較重，這提示線粒體A1555G突變易發(fā)生在線粒體單體型D個(gè)體中，而線粒體單體型B可導(dǎo)致或加重?cái)y帶線粒體A1555G突變個(gè)體的聽(tīng)力損失。然而對(duì)年齡與線粒體A1555G突變所致的聽(tīng)力損失相關(guān)性方面的研究甚少。本研究中我們發(fā)現(xiàn)線粒體A1555G突變所致的耳聾多數(shù)為極重度耳聾，占59.7%，尤其是發(fā)病年齡在≤1歲，＞1歲且≤3歲的，其聽(tīng)力損失程度為極重度的所占比例分別高達(dá)85.7%和72.2%（見(jiàn)表1），這一結(jié)果表明攜帶線粒體A1555G突變耳聾患者，嬰幼兒期出現(xiàn)耳聾的，以后其聽(tīng)力損失多數(shù)較重；而發(fā)病較晚的，其聽(tīng)力損失相對(duì)較輕。因此我們得出這一結(jié)論：線粒體A1555G突變致聾的患者，其聽(tīng)力損失程度與發(fā)病年齡呈負(fù)相關(guān)性，即發(fā)病越早，其聽(tīng)力損失越重，發(fā)病越晚，其聽(tīng)力損失越輕。從表2中我們可以看出，發(fā)病10年以上的，其聽(tīng)力損失程度的構(gòu)成比和發(fā)病10年以下的截然不同，發(fā)病10年以下的，其聽(tīng)力損失為輕度的占31.6%，極重度占31.6%，而發(fā)病10年以上的，其聽(tīng)力損失為輕度的所占比例不到2%，極重度卻高達(dá)70%以上，表2的結(jié)果提示隨著時(shí)間的推移，線粒體A1555G突變所致的聽(tīng)力損失會(huì)越來(lái)越嚴(yán)重。綜上所述，我們可以得出這一結(jié)論：線粒體A1555G突變所致的耳聾患者，其發(fā)病越早，病程越長(zhǎng)，其聽(tīng)力損失越嚴(yán)重。之所以會(huì)出現(xiàn)這一結(jié)果，可能是由于以下這些原因：①線粒體是細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)力站，細(xì)胞生命活動(dòng)中需要的能量約有80%來(lái)自于線粒體，是細(xì)胞進(jìn)行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的場(chǎng)所。同時(shí)，線粒體也是人體內(nèi)產(chǎn)生自由基的主要場(chǎng)所，線粒體不僅為細(xì)胞提供能量，還與細(xì)胞凋亡和自由基代謝有密切關(guān)系。隨著時(shí)間的推移，線粒體漸漸開(kāi)始出現(xiàn)衰老、凋亡，導(dǎo)致其功能缺陷越來(lái)越重，能量供給不足，影響細(xì)胞的新陳代謝，進(jìn)而加重其聽(tīng)力損失。②嬰幼兒期，患兒的生長(zhǎng)發(fā)育未完善，免疫力低下，一旦線粒體A1555G突變致病，其結(jié)果是嚴(yán)重的；另外，一些患兒是由于服用了氨基糖甙類藥物后出現(xiàn)的耳聾，嬰幼兒期患兒對(duì)藥物耐受能力較差，對(duì)藥物劑量較敏感，抵抗力不足，故病情較重。

本研究不足之處在于：首先，人類正常交流的語(yǔ)言頻率為500～3 000 Hz，當(dāng)其他頻率出現(xiàn)聽(tīng)力損失，或患者僅有輕度聽(tīng)力損失時(shí)，由于患者所處的地域、患者或家長(zhǎng)的重視程度、文化程度等不同，有些患者可能并未發(fā)覺(jué)自身聽(tīng)力損失，可能在準(zhǔn)確的發(fā)病年齡上及病程上存在誤差；其次，許多患者病史較長(zhǎng)，以前的客觀聽(tīng)力檢查報(bào)告單已丟失，我們只通過(guò)詢問(wèn)檢查發(fā)現(xiàn)耳聾的時(shí)間，可能存在一定的誤差。但是，“線粒體A1555G突變所致的耳聾患者，其發(fā)病越早，病程越長(zhǎng)，其聽(tīng)力損失越嚴(yán)重”這一結(jié)論，可以為臨床上粗略預(yù)測(cè)此類耳聾患者的病情發(fā)展趨勢(shì)提供依據(jù)。

[1]Guan MX. Mitochondrial 12S rRNA mutations associated with aminoglycoside ototoxicity[J]. Mitochondrion, 2011,11(2): 237-245.

[2]Pierce SB, Chisholm KM, Lynch ED, et al. Mutations in mitochondrial histidyl tRNA synthetase HARS2 cause ovarian dysgenesis and sensorineural hearing loss of Perrault syndrome[J]. Proc Natl Acad Sci, 2011, 108(16): 6543-6548.

[3]Lu J, Li Z, Zhu Y, et al. Mitochondrial 12S rRNA variants in 1642 Han Chinese pediatric subjects with aminoglycosideinduced and nonsyndromic hearing loss[J]. Mitochondrion, 2010, 10(4): 380-390.

[4]DiMauro S, Davidzon G. Mitochondrial DNA and disease [J]. Annals of medicine, 2005, 37(3): 222-232.

[5]Guan MX, Fischel-Ghodsian N, Attardi G. Nuclear background determines biochemical phenotype in the deafnessassociated mitochondrial 12S rRNA mutation[J]. Hum Mol Genet, 2001, 10(6): 573-580.

[6]Kong QP, Bandelt HJ, Sun C, et al. Updating the East Asian mtDNA phylogeny: a prerequisite for the identification of pathogenic mutations[J]. Hum Mol Genet, 2006, 15(13): 2076-2086.

[7]Li RH, Xing GQ, Yan M, et al. Cosegregation of C-insertion at position 961 with the A1555G mutation of the mitochondrial 12S rRNA gene in a large Chinese family with maternally inherited hearing loss[J]. Am J Med Genet, 2004, 124(2): 113-117.

[8]Young WY, Zhao LD, Qian YP, et al. Extremely low penetrance of hearing loss in four Chinese families with the mitochondrial 12S rRNA A1555G mutation[J]. Biochem Bioph Res Co, 2005, 328(4): 1244-1251.

[9]伍越, 鄭靜, 鄭斌嬌, 等. 氨基糖苷類抗生素耳毒性的保護(hù)和修飾[J]. 中華耳科學(xué)雜志, 2012, 10(2): 260-269.

[10]Lu J, Qian Y, Li Z, et al. Mitochondrial haplotypes may modulate the phenotypic manifestation of the deafnessassociated 12S rRNA 1555A>G mutation[J]. Mitochondrion, 2010, 10(1): 69-81.

（本文編輯：吳健敏）

Study on the relationship between age and hearing loss induced by mtDNA A1555G mutation

WANG

Yancang1, ZHANG Qiongmin2, ZHU Yi2.1.Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Otorhinolaryngology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To analyze the relevance among patient’s age of onset, duration of disease and their hearing loss whose deafness was caused by the mitochondrial DNA A1555G mutation, to provide a basis for predicting the progression of their disease.Methods:One hundred and fifty-four patients were divided into three groups according to their age of onset (≤1, >1 and≤3, >3), to analyze the degree of their hearing loss with statistical separately;and 156 patients were divided into three groups according to their duration of disease (≤10, >10 and≤20, >20), to analyze the degree of their hearing loss with statistical separately too.Results:The patients whose age of onset was under age 1 and between 1 and 3 years old had severe hearing loss in a high proportion (respectively 85.7% and 72.2%) (P=0.000); the patients, duration of disease was between 10 and 20 years and more than 20 years had severe hearing loss in a high proportion (respectively 74.1% and 70.3%) (P=0.000).Conclusion:The patient’s age of onset, duration of disease and their hearing loss whose deafness is caused by the mitochondrial DNA A1555G mutation are relevant, the earlier onset and longer duration, the more severe hearing loss, on the contrary, the less.

hearing loss; mitochondria; A1555G mutation; age

R764.43

A

1000-2138（2014）02-0083-04

2013-10-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（810 7079 4）。

王延藏（1984-），女，河南南陽(yáng)人，碩士生。

朱翌，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，Em ai l：otomito@gmail.com。