王孟蘭, 趙 妍, 陳明杰，2, 汪 虹

(1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 201403； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210095)

半纖維素是僅次于淀粉和纖維素的一大類碳水化合物，如秸稈中半纖維素的含量占其干重的25%～50%[1]。10年前的能源危機(jī)引起了科學(xué)家對由半纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究；此后，科學(xué)家們經(jīng)過努力，對半纖維素的種類、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)有了明確的認(rèn)識，鑒定、克隆了各種半纖維素酶及其基因，研究了多種能分解利用半纖維素的微生物，并對一些微生物進(jìn)行了代謝工程方面的研究。食用菌(edible fungi)是可供食用的蕈菌，而蕈菌則是指能形成大型的肉質(zhì)(或膠質(zhì))子實(shí)體或菌核組織的高等真菌的總稱。絕大多數(shù)食用菌是腐生性的，主要包括木腐菌和糞草菌[2]。糞草菌能以稻草、玉米、大豆等秸稈為主要生長基質(zhì)，通過生物轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^高附加值的食用子實(shí)體，因此具備纖維素、半纖維素酶系。草質(zhì)纖維是一個復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中木質(zhì)素側(cè)枝與半纖維素結(jié)合形成一個十分致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，將纖維素緊緊包裹在里面，所以要降解纖維素，必須先降解半纖維素和木質(zhì)素[3]。因此對于食用菌中半纖維素酶基因及其功能的研究，不僅有助于了解草質(zhì)纖維的降解機(jī)制，還將對研究半纖維素酶在實(shí)際生產(chǎn)中的有效應(yīng)用具有重要意義。

1 食用菌半纖維素酶系組成

食用菌降解半纖維素主要是β-1, 4-內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、α-葡萄糖醛酸酶等共同作用[4]。半纖維素酶系中的木聚糖酶主要為胞外酶，木糖苷酶屬胞內(nèi)酶。這樣的分布與酶的催化作用有一定的相關(guān)性。β-1, 4-內(nèi)切木聚糖酶(endo-1, 4-β-xylanase, EC 3.2.1.8)，簡稱木聚糖酶，主要作用于木聚糖主鏈的β-1, 4-糖苷鍵，產(chǎn)生低聚木糖或帶有側(cè)鏈的寡聚木糖，降低聚合度，因此木聚糖酶主要分布在胞外。β-木糖苷酶(β-xylosidase, EC 3.2.1.37)主要水解短鏈的低聚木糖或木二糖，并從非還原性末端釋放出木糖[5]，產(chǎn)生菌體能直接利用的糖，因此木糖糖苷酶主要分布在胞內(nèi)。而α-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55)[6]、α-葡萄糖醛酸酶(α-glucosiduronase, EC 3.2.1.139)[7]、乙酰木聚糖酯酶(acetylxylan esterase, EC 3.1.1.72)等主要分解側(cè)枝，與木聚糖酶和木糖糖苷酶協(xié)同起作用(見圖1)。據(jù)相關(guān)研究報道木聚糖酶和木糖苷酶是其中的關(guān)鍵酶[8]，目前針對木聚糖酶的研究也最多。

圖1半纖維素酶系的降解作用[8，9]

2 食用菌半纖維素酶系性質(zhì)

不同食用菌種類在不同的培養(yǎng)條件下所分泌的半纖維素酶具有不同的酶學(xué)特性，關(guān)于食用菌半纖維素酶系的木聚糖酶、木糖苷酶等的性質(zhì)都有研究報道。大部分食用菌所產(chǎn)的木聚糖酶都為中高溫的酸性酶[10]，最適反應(yīng)溫度在40℃～60℃之間，最適反應(yīng)pH值在4～6之間。裴建軍等[11]以蔗糖、果膠、羧甲基纖維素或木聚糖為碳源培養(yǎng)草菇(Volvariellavolvacea)V23菌株，對其所產(chǎn)生的半纖維素酶進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)半纖維素酶系主要受木聚糖誘導(dǎo)。草菇V23的木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH值為5.8，在pH值5.4～7.0時比較穩(wěn)定，保溫1 h酶活的半衰溫度是55℃；木糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH值為6.6，在pH值6.6～7.4時比較穩(wěn)定，保溫1 h酶活的半衰溫度是52℃；阿拉伯糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH值為5.0，在pH值4.6～6.2時比較穩(wěn)定，保溫1 h酶活的半衰溫度為60℃。張瑞景等[12]以玉米芯+麩皮作為碳源，硝酸銨作為氮源栽培蟹味菇(Hypsizigusmarmoreus)，發(fā)現(xiàn)有木聚糖酶產(chǎn)生，且木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度是35℃，最適反應(yīng)pH值為4.6。胡沂淮等[13]通過各級濃縮和純化，獲得接近電泳純的草菇胞外木聚糖酶并研究了其酶學(xué)性質(zhì)，草菇木聚糖酶相對分子質(zhì)量為24500，為糖基化修飾的蛋白，含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)20.24%的糖，O-糖基化能增加木聚糖酶的活性，O-和N-糖基化均能提高木聚糖酶的穩(wěn)定性，該酶的穩(wěn)定pH值為6.5，57℃時半衰期為1 h。

大部分食用菌的木糖苷酶的最適反應(yīng)溫度在40℃～60℃，最適pH值在5.0～7.0之間。吳華偉等[14]在發(fā)酵罐中以稻草粉為基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，分離純化了草菇中的木糖苷酶并研究了其酶學(xué)性質(zhì)，測得該酶由4個亞基組成，僅對對硝基苯基-β-D-木糖苷有專一水解作用；該酶催化反應(yīng)的最適溫度為55℃，最適pH值為6.41～6.76，在pH值5.78～7.68之間酶活性相對穩(wěn)定。

3 食用菌半纖維素酶系基因工程

目前已經(jīng)對多種重要食用菌進(jìn)行了全基因組測序與分析，如在分析草菇基因組時，Chen等[15]找到了285個編碼碳水化合物水解酶的基因，數(shù)字基因表達(dá)譜(Digital gene expression, DGE)分析發(fā)現(xiàn)其中239個基因有表達(dá)，且草菇糖苷水解酶的組成與其它擔(dān)子菌顯著不同，草菇中富含糖苷水解酶家族GH10(降解半纖維素)、GH43(降解半纖維素和果膠)。該結(jié)論與Bao等[16]的研究一致，且Bao等在對草菇基因組進(jìn)行測序與分析時發(fā)現(xiàn)，草菇中存在參與植物多糖降解的CAZy家族，分別有47、101、57個CAZymes與纖維素、半纖維素、果膠的降解有關(guān)，高于其它擔(dān)子菌相應(yīng)的值分別為36、77、37。草菇中存在大量糖苷水解酶家族GH10，推測為β-1, 4-內(nèi)切木聚糖酶[17]，是其它食用菌中該基因平均含量的4倍以上，表明草菇中含有豐富的編碼半纖維素酶系的基因。很多研究者還克隆了擔(dān)子菌中的其它半纖維素酶系基因，包括香菇(Lentinulaedodes)(AAL04152.1)[18]、裂褶菌(Schizophyllumcommune)(AAB29056.1)[19]等多種食用菌的半纖維素酶基因的信息(見表1)。

Piet等[20]從雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)中克隆了編碼木聚糖酶的基因xlnA，并在菌絲的生長過程中檢測到了xlnA基因的高效表達(dá)。丁少軍等[21]利用真菌CBD的高度保守性序列設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，用RACE方法進(jìn)行草菇V14木聚糖酶cDNA的克隆，并已在GenBank上登錄，編號為AY316307，命名為xyn1。目前以酵母細(xì)胞作為宿主，使部分食用菌的半纖維素酶基因得到了異源表達(dá)。葉戔等[22]成功克隆了平菇(Pleurotusostreams)木聚糖酶cDNA，并在畢赤酵母GS115中進(jìn)行了異源表達(dá)，測得該重組酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH值為6.6，在pH值5.5～8.5范圍內(nèi)能維持50%以上的酶活性，在70℃處理5 min則完全失活，在50℃和60℃處理10 min，分別殘余82.3%和41.0%的活性，并且該重組酶對山毛櫸木聚糖具有很好的水解效果。對于除木聚糖酶以外的半纖維素酶，學(xué)者們也開始了分子生物學(xué)研究，且初見成效。Ding等[23]克隆了草菇V14菌株的乙酰木聚糖酯酶基因，并在GenBank上登錄(編號ABI63599.1)，隨后在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了其高效表達(dá)。Chong等[24]在裂褶菌(Schizophyllumcommune)中克隆了α-葡萄糖醛酸酶基因agu1，并分析了該基因與木聚糖酶基因xynA的協(xié)同表達(dá)情況。謝春芳等[25]通過對假密環(huán)菌(Armillariellatabescens)cDNA克隆文庫的隨機(jī)測序及RACE技術(shù)，成功獲得了阿拉伯糖苷酶的全長cDNA，并用生物信息學(xué)方法對其進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該全長cDNA序列與多形擬桿菌的阿拉伯糖苷酶序列具有較高的同源性，在畢赤酵母菌GS115中對所獲得的基因進(jìn)行了高效表達(dá)，相對酶活性達(dá)到了81.25%。

表1 已克隆報道的幾種主要食用菌的半纖維素酶基因

高效產(chǎn)酶工程菌的構(gòu)建，將對半纖維素酶的應(yīng)用起到巨大推動作用。Cheng等[29]構(gòu)建了毛柄金錢菌gpd啟動子驅(qū)動的福壽螺多功能纖維素酶基因mfc的真核表達(dá)載體，采用PEG介導(dǎo)法成功地將目的基因重組到色氨酸營養(yǎng)缺陷型灰蓋鬼傘的染色體上，分子鑒定與酶活力測定結(jié)果表明：mfc基因確實(shí)已整合到灰蓋鬼傘基因組中，能夠?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)，其木聚糖酶活力為235 U/mL，達(dá)到對照組的2.97倍。隨著食用菌轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展與日趨成熟，有望實(shí)現(xiàn)將更多編碼半纖維素降解酶的基因?qū)朐耘嗍秤镁校蕴岣咂鋵υ耘嗷|(zhì)的利用率或用于開發(fā)新型栽培基質(zhì)，從而提高栽培食用菌的產(chǎn)量與質(zhì)量。

4 食用菌半纖維素酶系活性

食用菌(尤其是糞草菌)的栽培原料有較大一部分來自農(nóng)作物的秸稈。碳水化合物活性酶，如水解植物細(xì)胞壁多糖的纖維素酶與半纖維素酶在基質(zhì)降解過程中扮演了重要的角色。Ahlawat等[30]以草菇不同菌株為試驗(yàn)材料，研究發(fā)現(xiàn)木聚糖酶活性在合成培養(yǎng)基中對草菇產(chǎn)量十分關(guān)鍵。李曉博等[31]測定了培養(yǎng)料不同發(fā)酵階段與接種雙孢蘑菇后不同生長階段的半纖維素酶活性變化及培養(yǎng)料中半纖維素含量的改變，試驗(yàn)結(jié)果表明：在培養(yǎng)料發(fā)酵與雙孢蘑菇生長發(fā)育期間，半纖維素酶活性的變化與半纖維素的降解速率成正相關(guān)，即酶活性高降解速率快，酶活性低降解速率慢；同時還選用了不同培養(yǎng)料來栽培雙孢蘑菇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用稻草的產(chǎn)量是最高的。Isikhuemhen等[32]使用厭氧發(fā)酵的復(fù)合培養(yǎng)料培養(yǎng)平菇菌絲，并對平菇的產(chǎn)量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)加入70%～80%秸稈、10%～20%固體廢物、10%～20%粟的復(fù)合培養(yǎng)料袋栽的平菇產(chǎn)量最高，達(dá)到了874.8～958.3 g/kg；同時他們還比較了不同培養(yǎng)料處理的纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素減少量，發(fā)現(xiàn)纖維素與半纖維素的減少量與產(chǎn)量呈正相關(guān)，而木質(zhì)素的大量減少不一定形成高的平菇產(chǎn)量；進(jìn)一步的酶活性測定結(jié)果表明，木聚糖酶的活性在出菇后更高，其活性高低與子實(shí)體產(chǎn)量呈正相關(guān)。他們[33]對茶樹菇(Agrocybeaegerita)的產(chǎn)量與半纖維素酶活性方面也做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)茶樹菇在合成培養(yǎng)基中生長時會降解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，其中木聚糖酶在出菇后活性高，而木糖苷酶在第2次出菇潮時活性升高，即半纖維素酶活性與茶樹菇子實(shí)體的形成相關(guān)。

5 問題與展望

半纖維素是一類極為豐富的自然資源，廣泛存在于農(nóng)業(yè)廢棄物中，其降解產(chǎn)物可作為一種較好的碳源，食用菌能夠利用這些碳源產(chǎn)生供人們食藥用的子實(shí)體，從而達(dá)到農(nóng)業(yè)固廢循環(huán)的高效利用。食用菌的半纖維素酶系主要是受木聚糖誘導(dǎo)，酶系中各組分酶的表達(dá)分泌是一個受碳源誘導(dǎo)和生長周期兩個因素、轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平上的多重調(diào)控系統(tǒng)[34]，其具體的誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不十分明了。若能深入開展食用菌半纖維素酶系表達(dá)調(diào)控機(jī)理及半纖維素代謝途徑的研究，將有可能從根本上促進(jìn)食用菌(尤其是糞草菌)利用植物纖維素的效率。

除了在食用菌栽培中起作用，半纖維素酶系已經(jīng)在更多領(lǐng)域里得到應(yīng)用，如在谷物食品(主要是面包)上，應(yīng)用木聚糖酶可以水解谷物面粉中的木聚糖產(chǎn)生木寡糖，從而大大改善了面包的質(zhì)地、結(jié)構(gòu)以及松軟度；同時將半纖維素酶用于漂白硫酸鹽紙漿，其優(yōu)點(diǎn)在于能夠提高紙漿的可漂性而減少氯的使用量，從而減輕了對環(huán)境的污染。隨著對半纖維素酶系不斷地深入研究，相信其在乙醇發(fā)酵生產(chǎn)、食品加工、低聚糖制備、飼料加工、紙漿溶解以及紙漿漂白等諸多方面都將具有廣闊的應(yīng)用前景。

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