許文炯 王 燕 王 璇 喬夢凱 董 敏 何 敏 石利民 董瀟瀟 惲?xí)r鋒 丁 潔

(南京市疾病預(yù)防控制中心，南京 210003)

大多數(shù)細(xì)菌和病毒感染都起始于機(jī)體的呼吸道、泌尿生殖道、腸道等黏膜表面［1］。由于黏膜免疫系統(tǒng)具有相對獨(dú)立性，用于預(yù)防黏膜系統(tǒng)感染的疫苗也最好經(jīng)由黏膜途徑投入。黏膜疫苗不僅可誘導(dǎo)全身的系統(tǒng)T、B 淋巴細(xì)胞反應(yīng)，還能誘導(dǎo)局部黏膜免疫應(yīng)答，包括能產(chǎn)生局部分泌型IgA，以及誘導(dǎo)黏膜CTL 反應(yīng)，對于阻止病原體通過黏膜途徑傳播和感染具有重要意義。當(dāng)前，疫苗研究趨勢是向重組蛋白疫苗而非全菌或病毒的疫苗方向發(fā)展，而在缺乏佐劑的情況下機(jī)體針對可溶性蛋白的免疫通常較弱。尋找有效的能增強(qiáng)免疫反應(yīng)的佐劑就顯得尤為重要［2］。佐劑可非特異性地通過物理或化學(xué)方式與特異免疫原結(jié)合，其在疫苗研究中的作用主要是非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的體液或細(xì)胞免疫，增強(qiáng)免疫反應(yīng)強(qiáng)度和持久性，提高機(jī)體保護(hù)能力。好的免疫佐劑可使少量的抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生早期、高效和持久的免疫應(yīng)答。

Lycke 等［3］構(gòu)建了CTA1-DD——一個(gè)由霍亂毒素的A1 亞單位(CTA1)與葡萄球菌A 蛋白D 片段的二聚體(DD)連接而成的基因融合蛋白。CTA1-DD 進(jìn)入機(jī)體后可以與天然B 細(xì)胞和記憶B細(xì)胞結(jié)合，上調(diào)協(xié)同刺激分子，組織活化的B 細(xì)胞凋亡。CTA1-DD 已經(jīng)在很多候選疫苗中應(yīng)用過，基礎(chǔ)研究表明它是我們已知的最有發(fā)展前景的黏膜佐劑之一。Zou［4］的研究首次表明，由于這種蛋白DD區(qū)域可非特異性地與免疫球蛋白連接，通過某種機(jī)制，CTA1-DD 與非特異性多克隆IgG 形成的CTA1-DD/IgG 復(fù)合物可更好地激活肥大細(xì)胞，從而發(fā)揮其免疫增強(qiáng)效應(yīng)。

關(guān)于CTA1-DD/IgG 復(fù)合物的佐劑作用，目前已報(bào)道的研究很少，有必要進(jìn)一步研究，以判斷其應(yīng)用價(jià)值。本研究中，我們將模式抗原(雞卵清白蛋白OVA)與作為佐劑的CTA1-DD/IgG 復(fù)合物一起，進(jìn)行小鼠鼻內(nèi)免疫，觀察對IgG 抗體生成和脾臟抗體分泌細(xì)胞的影響，進(jìn)一步闡述CTA1-DD/IgG 佐劑的免疫調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)將研究報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6～8 周齡SPF 級雌性BALB/c小鼠，購自并飼養(yǎng)于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科內(nèi)。

1.1.2 抗原與佐劑 雞卵清白蛋白OVA 購于Sigma 公司;CTA1-DD 由鄒翔博士贈送。

1.1.3 其他試劑及儀器 酶標(biāo)儀(Bio-Rad Benchmark-plus);酶標(biāo)板Coster;二級生物安全柜(新加坡ESCO MICRO PTE LTD);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(MEMMER);離心機(jī)(Beckman Coulter)。小鼠IgG 購自Sigma;Elispot 微孔板購自Milpore;Coat anti-mouse IgG secondary Antibody (peroxidase conjugated)(1∶4萬)，購自SAB;anti-mouse IgG1-HRP(1∶30 萬)，購自Sigma;anti-mouse IgG2a-HRP(1∶9萬)，Sigma;anti-mouse IgG2b-HRP(1 ∶6.5 萬)，Sigma;antimouse IgG3-HRP(1∶3.1 萬)，Sigma;RPMI1640，Hyclone 胎牛血清，Hyclone;Anti-mouse IgG Biotin antibody，Sigma;Strepataridin-Alkaline phosphatase，Sigma。

1.2 方法

1.2.1 免疫方案及樣品收集 腹腔注射0.3 ml 0.6 % 氯胺酮，使小鼠輕度麻醉，其后緩慢滴鼻接種(某些試驗(yàn)中為腹腔接種)OVA 和佐劑(或PBS)混合物，其中含有100 μg OVA 和 適量佐劑(CTA1-DD 或CTA1-DD/IgG)。CTA1-DD 與IgG 按照摩爾比1∶5混合，37℃15 min 形成復(fù)合物［4］。兩次免疫間隔時(shí)間為10 d，于最后1 次免疫后10 d 時(shí)采集樣品。采集小鼠血液，分離制備血清。將小鼠脾臟研磨后通過70 μm 細(xì)胞網(wǎng)篩(BD Biosciences)，轉(zhuǎn)移入10 ml 離心管，用Tris-NH4Cl 裂解紅細(xì)胞，洗滌3次，得到單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

1.2.2.1 血清特異性IgG 檢測 將OVA 用PBS 溶解至200 μg/ml，100 μl/well，4℃過夜，保持濕度。PBS-T(含0.05% 吐溫20)洗滌3 次。1.5% BSA(PBS 溶解)200 μl 每孔，37℃30 min，PBS-T 洗滌2次。加入經(jīng)0.2%BSA(0.05% PBS-T 溶解)倍比稀釋的標(biāo)本，100 μl/well，3 個(gè)復(fù)孔。室溫2 h 孵育，用PSB-T 洗滌3 次。加經(jīng)0.2%BSA(0.05% PBS-T 溶解)適當(dāng)稀釋的Coat anti-mouse IgG secondary Antibody (peroxidase conjugated)為二抗，100 μl/well。室溫2 h 孵育。用PSB-T 洗滌3 次。顯色液100 μl/well，室溫顯色15 min。加終止液，波長450 處測吸光度OD 值。以O(shè)D 值比背景值高0.1 的血清最大稀釋度的倒數(shù)Log2 作為抗體滴度［5］，比較各組之間的顯著性差異。

1.2.2.2 血清特異性抗體亞型檢測 OVA 包被、洗滌同上。每孔加入1∶1 000 的待檢血清，孵育、洗滌同上。每個(gè)樣本分別加入4 種適當(dāng)稀釋的二抗:anti-mouse IgG1-HRP、anti-mouse IgG2a-HRP、antimouse IgG2b-HRP、anti-mouse IgG3-HRP，每種二抗對應(yīng)3 個(gè)復(fù)孔。顯色、終止、測定同上。比較各組之間的OD450 的顯著性差異。

1.2.3 脾臟IgG 抗體分泌細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT) 將100 μl OVA (濃度1 mg/ml)預(yù)先加入PVDF 膜的ELISPOT 微孔板中，4℃過夜;PBS 洗滌6 次后加入R10(200 μl)，室溫封閉1 h ;將小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞濃度調(diào)整為1 ×107個(gè)活細(xì)胞/ml 和2.5 ×106個(gè)活細(xì)胞/ml，每個(gè)樣本分別取100 μl 上述兩種濃度細(xì)胞懸液至兩個(gè)檢測孔。37℃5%CO2孵育16～20 h。200 μl PBST 洗板6 次，每孔加入Anti-mouse IgG Biotin Conjugate 檢測抗體100 μl(1 μg/ml)，室溫孵育2 h，200 μl PBST 洗板3 次;加入100 μl 稀釋好的Strepataridin-ALP，室溫孵育2 h，200 μl PBST 洗板6 次;加入50 μl BCIP/NBT 底物溶液，室溫避光孵育15～35 min，用蒸餾水或去離子水充分洗滌孔的內(nèi)部，反應(yīng)板放置于通風(fēng)良好的地方自然晾干，計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 GraphPad Prism 4 軟件(Graph-Pad Software)用于數(shù)據(jù)繪圖。試驗(yàn)結(jié)果以±s 表示。多組之間的組間差異采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0分析，依次選擇單因素方差分析和LSD 函數(shù)進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較，P ＜0.05 時(shí)表明組間有顯著差異，P ＜0.01 時(shí)為組間差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 CTA1-DD 濃度的確定 我們首先檢測了OVA抗原聯(lián)合CTA1-DD 佐劑經(jīng)鼻腔或腹腔途徑免疫小鼠后對IgG 抗體滴度的影響，以確定所用的CTA1-DD 濃度。二免后10 d 小鼠血清特異性IgG 抗體滴度檢測結(jié)果如圖1 所示，表明經(jīng)鼻腔黏膜免疫途徑或腹腔接種途徑，CTA1-DD 佐劑均能有效提高抗原免疫效果。5 μg CTA1-DD 佐劑組和20 μg CTA1-DD佐劑組的IgG 抗體滴度均顯著高于100 μg 抗原單獨(dú)免疫組;5 μg 和20 μg CTA1-DD 佐劑組之間誘導(dǎo)IgG 抗體水平相近。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，我們選取5 μg CTA1-DD 作為試驗(yàn)濃度。

圖1 抗-OVA IgG 抗體滴度Fig.1 Anti-OVA protein serum IgG titers

圖2 OVA 抗原經(jīng)鼻聯(lián)合免疫CTA1-DD/IgG 促進(jìn)特異性IgG 抗體生成Fig.2 Intranasal immunization of mice with OVA in combination with CTA1-DD/IgG elicits a higher level of OVA-specific IgG Ab

2.2 CTA1-DD/IgG 佐劑對OVA 引起的IgG 抗體應(yīng)答 見圖2。CTA1-DD/IgG 或CTA1-DD 作為佐劑聯(lián)合OVA 免疫均可促進(jìn)OVA 特異性IgG 抗體生成，其中CTA1-DD 佐劑組與單用OVA 抗原組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)，CTA1-DD/IgG 佐劑組與單用OVA 抗原組有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)，但CTA1-DD/IgG 組與CTA1-DD 組之間未見顯著性差異，雖然CTA1-DD/IgG 組誘導(dǎo)的IgG 水平高于CTA1-DD 組。

2.3 通過制備BALB/c 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用ELISPOT 試驗(yàn)測定其中的OVA 特異性抗體分泌細(xì)胞，結(jié)果如圖3 所示。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)OVA 抗原與CTA1-DD/IgG 佐劑聯(lián)合免疫時(shí)，與CTA1-DD 佐劑組相比，脾臟的IgG 抗體分泌細(xì)胞顯著增加，P ＜0.001。

2.4 CTA1-DD/IgG 佐劑對OVA 引起的抗體亞型應(yīng)答 見圖4。CTA1-DD/IgG 復(fù)合物或CTA1-DD作為佐劑聯(lián)合OVA 免疫所產(chǎn)生的IgG 抗體亞型分布類似:IgG1、IgG2a、IgG2b 抗體皆提高;IgG2a/IgG1 ＞1，同時(shí)產(chǎn)生了較高IgG2b類抗體;IgG3抗體未見增高。表明CTA1-DD/IgG 復(fù)合物或CTA1-DD 作為佐劑促進(jìn)OVA 抗原經(jīng)鼻腔免疫以Th1 應(yīng)答為主，Th1 型和Th2 型免疫反應(yīng)均有提高。CTA1-DD/ IgG組與CTA1-DD 組之間誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG1 抗體比較，P=0.069。

圖3 CTA1-DD/IgG 促進(jìn)OVA 誘導(dǎo)的特異抗體分泌細(xì)胞Fig.3 CTA1-DD/IgG complex provokes greater numbers of anti-OVA-specific antibody-secreting cells in BALB/c mice

圖4 OVA 抗原經(jīng)鼻聯(lián)合免疫CTA1-DD/IgG 誘導(dǎo)特異性IgG 抗體的亞型分析Fig.4 Characterization of OVA-specific serum IgG subclass response in mice intranasally immunized with OVA in combination with CTA1-DD/IgG

3 討論

我們的結(jié)果表明CTA1-DD/IgG 佐劑的免疫調(diào)節(jié)作用強(qiáng)于CTA1-DD，但是IgG 抗體的產(chǎn)生并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在文獻(xiàn)［4］中，以NP 作為模式抗原，CTA1-DD/IgG 佐劑在BALB/c 小鼠中誘導(dǎo)IgG 抗體的產(chǎn)生高于CTA1-DD 佐劑，有顯著性差異;在C57BL/6 小鼠中誘導(dǎo)IgG 抗體的產(chǎn)生亦高于CTA1-DD 佐劑，但沒有顯著性差異，P 值為0.058 ＞0.05。我們用OVA 抗原在BALB/c 小鼠中得到的結(jié)果，與其用NP 作為模式抗原在C57BL/6 小鼠中得到的結(jié)果類似。此外，我們的結(jié)果表明CTA1-DD/IgG 佐劑組的脾臟特異性抗體分泌細(xì)胞與CTA1-DD 佐劑組相比，有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與文獻(xiàn)［4］檢測BALB/c 小鼠骨髓特異性抗體分泌細(xì)胞所得結(jié)果一致。

抗OVA 特異性IgG 抗體亞型分布提示了所產(chǎn)生的Th 細(xì)胞亞型。在小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生IgG2a 抗體表明Th1 反應(yīng)占主導(dǎo)地位，同時(shí)Th2 反應(yīng)與選擇性誘導(dǎo)IgG1 抗體有關(guān)［6］。我們檢測了小鼠在CTA1-DD或CTA1-DD/IgG 兩種佐劑作用下產(chǎn)生OVA-特異性抗體的亞型分布。CTA1-DD 或CTA1-DD/IgG 佐劑不僅增加抗體滴度，相對于其他抗體亞型而言，這種增加對OVA 特異性IgG2a 更加顯著，且IgG2a/IgG1＞1，表明CTA1-DD 或CTA1-DD/IgG 佐劑可能優(yōu)先增強(qiáng)Th1 型反應(yīng)。顯著的Th1 型應(yīng)答有利于機(jī)體對胞內(nèi)病原的清除，減輕持續(xù)性感染。平衡的Th1/Th2 反應(yīng)有利于克服機(jī)體對抗原的不應(yīng)答性。文獻(xiàn)［7］也表明，CTA1-DD 可刺激一個(gè)平衡的Th1/Th2反應(yīng)。因此，我們認(rèn)為，對于某些主要誘導(dǎo)抗體反應(yīng)的抗原而言，使用CTA1-DD/IgG 佐劑的優(yōu)點(diǎn)是可能使免疫反應(yīng)向更平衡的Th1/Th2 方向轉(zhuǎn)化。

IgG 與CTA1-DD 形成復(fù)合物后，可通過與肥大細(xì)胞的Fc 受體結(jié)合而更好地激活肥大細(xì)胞，從而發(fā)揮其免疫增強(qiáng)效應(yīng)［4］。例如，CTA1-DD/IgG 可通過FcγRⅢA 介導(dǎo)的途徑活化黏膜下層的CTMCs［8］。

綜上所述，本文進(jìn)一步探討了CTA1-DD/IgG 的免疫佐劑作用，認(rèn)為聯(lián)合該佐劑從黏膜途徑免疫所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答優(yōu)于CTA1-DD，且可產(chǎn)生混合的IgG 亞類，有較好的應(yīng)用前景。

［1］Inderjit Jabbal-Gill.Nasal vaccine innovation［J］.J Drug Targeting，2010，18(10):771-786.

［2］Tovey MG，Lallemand C.Adjuvant activity of cytokines［J］.Methods Mol Biol，2010，626:287-309.

［3］Lycke N.From toxin to adjuvant:basic mechanisms for the control of mucosal IgA immunity and tolerance［J］.Immunol Lett，2005，97:193-198.

［4］Fang Y，Larsson L，Mattsson，et al.Mast cells contribute to the mucosal adjuvant effect of CTA1-DD after IgG-complex formation［J］.J Immunol，2010，185:2935-2941.

［5］Campos EA，Namikoshi J，Maeba S，et al.Nasally administered cholera toxin A-subunit acts as a mucosal adjuvant［J］.J Oral Sci，2003，45(1):25-31.

［6］Snapper CM，Paul WE.Interferon-gamma and B cell stimulatory factor-1 reciprocally regulate Ig isotype production［J］.Science，1987，236:944-947.

［7］Eriksson A，Lycke N.The CTA1-DD vaccine adjuvant binds to human B cells and potentiates their T cell stimulating ability［J］.Vaccine，2003，22(2):185-193.

［8］Fang Y，Zhang T，Lidell L，et al.The immune complex CTA1-DD/IgG adjuvant specifically targets connective tissue mast cells through FcgammaRIIIA and augments anti-HPV immunity after nasal immunization［J］.Mucosal Immunol，2013，6(6):1168-1178.