桑麗雅，朱曉華，鄭百芹，董李學(xué)，邵偉，王振國(guó)

（1.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司，浙江杭州310022；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇南京210017；3.唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，河北唐山063000）

水產(chǎn)品孔雀石綠和隱性孔雀石綠快速定量檢測(cè)研究

桑麗雅1，朱曉華2，鄭百芹3，董李學(xué)3，邵偉1，王振國(guó)1

（1.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司，浙江杭州310022；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇南京210017；3.唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，河北唐山063000）

采用膠體金免疫層析方法建立了水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的定量檢測(cè)，并對(duì)其樣品前處理方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，孔雀石綠的線性范圍為0.25μg/L～8μg/L，線性系數(shù)0.996 1；優(yōu)化后孔雀石綠提取液的pH為4.5，對(duì)甲苯磺酸濃度為0.06mol/L，凈化劑為2 g中性氧化鋁，脫水劑為2 g氯化鈣，氧化劑為100μL 0.1%四氯苯醌；孔雀石綠加標(biāo)回收率為80.1%～89.6%，隱性孔雀石綠加標(biāo)回收率為66.9%～72.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.07%～8.14%。

孔雀石綠；隱性孔雀石綠；水產(chǎn)品；膠體金；樣品前處理

孔雀石綠（malachite green，MG）屬三苯甲烷類化學(xué)物質(zhì)，被廣泛用于預(yù)防和治療各類水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等[1]?？兹甘G及其代謝物隱形孔雀石綠（leucomalachite green，LMG）在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生高殘留，殘留時(shí)間可達(dá)100 d以上，對(duì)人體具有致癌、致畸和致突變的副作用[2]。世界上許多國(guó)家已將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物，中國(guó)也于2002年5月將孔雀石綠列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》（農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告）。

孔雀石綠及其代謝物隱性孔雀石綠的主流檢測(cè)方法是高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[3-4]，該技術(shù)除需配備昂貴的大型儀器和大量輔助實(shí)驗(yàn)設(shè)備外，前處理方法過(guò)于繁雜耗時(shí)，無(wú)法應(yīng)對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管發(fā)展需求。近幾年，農(nóng)業(yè)部在水產(chǎn)品監(jiān)管方面引入市場(chǎng)準(zhǔn)入與質(zhì)量追溯試點(diǎn)工作，免疫膠體金快速檢測(cè)技術(shù)因具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、便宜的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于對(duì)產(chǎn)地和流通市場(chǎng)的樣品進(jìn)行常規(guī)篩選檢測(cè)[5]。

孔雀石綠是水產(chǎn)品藥物殘留必檢項(xiàng)目之一，但是當(dāng)前市面上的孔雀石綠快速檢測(cè)試劑盒質(zhì)量卻差強(qiáng)人意，一方面前處理方法涉及過(guò)柱等步驟不夠簡(jiǎn)單快速，另一方面不能同時(shí)檢測(cè)顯性和隱性孔雀石綠，且不能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)[6]。針對(duì)此種情況，本試驗(yàn)對(duì)水產(chǎn)品中孔雀石綠及代謝物的前處理方法作了深入研究，并應(yīng)用到免疫膠體金快速檢測(cè)方法中實(shí)現(xiàn)對(duì)顯隱性孔雀石綠的快速定量檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料

經(jīng)LC-MS/MS法（GB/T 19857-2005.水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定）確證的陰性南美白對(duì)蝦、鯽魚。

1.1.2 試劑

孔雀石綠（MG）、隱性孔雀石綠（LMG）：美國(guó)Sigma公司；對(duì)甲苯磺酸、乙酸銨、鹽酸羥胺、乙腈、中性氧化鋁、硅藻土、正己烷、氯化鈣、過(guò)氧化鉛、高碘酸、四氯苯醌、高錳酸鉀（均為分析純）：華東醫(yī)藥股份有限公司器材化劑分公司；30%雙氧水：西安三浦化學(xué)試劑有限公司；孔雀石綠免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板：杭州南開日新生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.3 儀器

PL-203電子天平：梅特勒-托利多（中國(guó)）；SRH-S 450均質(zhì)機(jī)：上海世赫機(jī)電設(shè)備有限公司；TDL-40C低速臺(tái)式大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DCY-08空氣吹干儀：杭州南開日新生物有限公司；HG-8金標(biāo)讀數(shù)儀：杭州南開日新生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制定標(biāo)準(zhǔn)曲線

用乙腈和磷酸鹽（PBS）緩沖液配制系列濃度孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0、0.25、0.5、1、2、4、8、12、16、20、100μg/L。不同濃度孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品液用膠體金快速檢測(cè)試劑板測(cè)定，測(cè)定結(jié)果T/C值（T—檢測(cè)線的吸光值，C—控制線的吸光值）用金標(biāo)讀數(shù)儀讀取。以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品液濃度為橫坐標(biāo)，T/C值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.2.2 樣品前處理方法的初步確定

取魚、蝦等水產(chǎn)樣品的可食肌肉部分，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)；稱取5 g均質(zhì)后樣品于50 mL離心管中；加入3mL鹽酸羥胺、對(duì)甲苯磺酸和乙酸銨的混合提取液、10mL乙腈和凈化劑到離心管中，劇烈振蕩3min；加入Xg氯化鈣，劇烈振蕩1min后，室溫下4 000 r/min離心5min；移取5mL上清液于離心管中，加入氧化劑，混合均勻1min后，65℃用氮?dú)饣蚩諝獯蹈?；向吹干的試管中加?.5mL pH7.4 PBS緩沖液，沖洗溶解試管內(nèi)壁上殘留物，靜置2min，吸取至少0.1mL溶液，待檢。樣品稀釋倍數(shù)為1。

1.2.3 樣品提取液的優(yōu)化

1.2.3.1 不同pH緩沖液對(duì)孔雀石綠回收率的影響

配制pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的乙酸銨緩沖溶液，3μg/kg孔雀石綠加標(biāo)樣品做前處理后滴定孔雀石綠膠體金快速檢測(cè)試劑板，用金標(biāo)讀數(shù)儀測(cè)定T/C值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收值，計(jì)算回收率，考察不同pH乙酸銨緩沖液對(duì)孔雀石綠回收率的影響。

1.2.3.2 不同濃度對(duì)甲苯磺酸對(duì)孔雀石綠回收率的影響

配制對(duì)甲苯磺酸系列濃度溶液：0.03、0.045、0.06、0.075、0.09mol/L，3μg/kg孔雀石綠加標(biāo)樣品做前處理后滴定孔雀石綠膠體金快速檢測(cè)試劑板，用金標(biāo)讀數(shù)儀測(cè)定T/C值，計(jì)算回收率，考察不同濃度對(duì)甲苯磺酸溶液對(duì)孔雀石綠回收率的影響。

1.2.4 樣品凈化劑的優(yōu)化

3μg/kg孔雀石綠加標(biāo)樣品的前處理過(guò)程中分別加入不同凈化：中性氧化鋁（過(guò)中性氧化鋁柱和直接添加2 g中性氧化鋁兩種方式）、3 g硅藻土、正己烷，前處理后滴定孔雀石綠膠體金快速檢測(cè)試劑板，用金標(biāo)讀數(shù)儀測(cè)定T/C值，計(jì)算回收率，考察不同凈化劑對(duì)孔雀石綠回收率的影響。

1.2.5 樣品脫水劑的優(yōu)化

3μg/kg孔雀石綠加標(biāo)樣品的前處理過(guò)程中分別加入不同量0.5、1、2、4、6 g CaCl2，振蕩離心后觀察上清液體積、記錄吹干時(shí)間，計(jì)算回收率。

1.2.6 樣品中隱性孔雀石綠氧化條件的優(yōu)化

添加隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品到5 g空白水產(chǎn)品中，使終濃度為3μg/kg。樣品前處理過(guò)程中分別加入不同氧化劑：100μL雙氧水、100mg過(guò)氧化鉛、10μL 1%高碘酸溶液、100μL 0.1%四氯苯醌、10μL 1%高錳酸鉀溶液，樣品前處理后滴定孔雀石綠膠體金快速檢測(cè)試劑板，用金標(biāo)讀數(shù)儀測(cè)定T/C值，計(jì)算回收率，考察不同氧化劑對(duì)隱性孔雀石綠的轉(zhuǎn)化效果。

1.2.7 方法的回收率和精密度測(cè)定

經(jīng)LC-MS/MS法確證后的孔雀石綠陰性鯽魚、南美白對(duì)蝦樣品中，分別添加0.25、2、8μg/kg孔雀石綠和隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品液，每個(gè)濃度做6個(gè)平行，經(jīng)優(yōu)化后的樣品前處理后，用孔雀石綠膠體金快速檢測(cè)試劑板和金標(biāo)讀數(shù)儀測(cè)定T/C值、計(jì)算回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制孔雀石綠梯度系列濃度，用膠體金快速檢測(cè)試劑板測(cè)定，顯色結(jié)果（T/C值）用金標(biāo)讀數(shù)儀讀取。由圖1可見，孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)曲線冪方程為y=1.1686x-0.396，R2=0.996 1?？兹甘G在0.25μg/L～8μg/L范圍內(nèi)具有很好的線性。

圖1 孔雀石綠免疫膠體金檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of immunographic colloidal gold

2.2 提取緩沖液最佳pH

孔雀石綠是一種偏堿性物質(zhì)，在酸性條件下容易被提取出來(lái)。不同pH乙酸銨緩沖液對(duì)孔雀石綠回收率的影響見圖2。

圖2 不同pH乙酸銨緩沖液對(duì)孔雀石綠回收率的影響Fig.2 The influence of various pH of amine acetate buffer solution on the malachite green recovery ratio

由圖2可見，當(dāng)緩沖溶液的pH為4.5時(shí)，水產(chǎn)樣品回收率最高，因此確定提取水產(chǎn)樣品中孔雀石綠的最佳pH為4.5。

2.3 提取液中對(duì)甲苯磺酸的最佳濃度

對(duì)甲苯磺酸溶液作為離子對(duì)試劑，有利于孔雀石綠形成離子對(duì)，增加乙腈對(duì)該物質(zhì)的提取效率[7]。不同濃度對(duì)甲苯磺酸溶液對(duì)孔雀石綠回收率的影響見圖3。

圖3 不同濃度對(duì)甲苯磺酸溶液對(duì)孔雀石綠回收率的影響Fig.3 The influence of p-toluenesulfonic acid solution on the malachite green recovery ratio

由圖3可見，增加對(duì)甲苯磺酸溶液濃度樣品回收率隨之增加，當(dāng)對(duì)甲苯磺酸濃度大于0.06mol/L時(shí)，增加用量回收率變化不大。故5 g含孔雀石綠含量24μg/L的水產(chǎn)樣品需要0.06mol/L的對(duì)甲苯磺酸溶液3mL。

2.4 凈化劑

孔雀石綠脂溶性，為提高提取效率，需要除脂。不同凈化劑對(duì)孔雀石綠回收率的影響見圖4。

圖4 不同除脂劑對(duì)孔雀石綠回收率的影響Fig.4 The influence of various degreasing agents on the malachite green recovery ratio

由圖4可見，中性氧化鋁的除脂效果最好，過(guò)柱和添加粉末兩種方式效果差別不大，硅藻土和正己烷的除脂效果較差。試驗(yàn)結(jié)果從另一方面說(shuō)明了待檢樣品溶液中脂肪含量高對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響很大。

2.5 脫水劑

因乙腈與提取液中的水互溶，考慮后續(xù)吹干步驟及提高提取率需要除水。為減少吹干溶劑體積，選用除水效果好的固相脫水劑CaCl2。加入不同量CaCl2離心后，見圖5。

圖5 加入不同量CaCl2離心后的液體分層情況Fig.5 The centrifugal liquid stratifications after adding different concentrations of CaCl2

從圖5可知，離心后離心管中混合物共分成3層，下層固體層為肉樣、中性氧化鋁、氯化鈣混合物，中間液體層主要成分為水，上層液體層主要成分為乙腈。

各液體層體積、5mL上層液體溶液吹干時(shí)間及回收率情況，見表1。

從表1數(shù)據(jù)來(lái)看，隨著CaCl2用量增加，水層的體積依次增加，乙腈層的體積依次減少，5mL上層液體吹干時(shí)間呈減少趨勢(shì)，但CaCl2用量為0.5 g和1 g的吹干時(shí)間差不多，用量為2、4、6 g的吹干時(shí)間差不多。但是就回收率來(lái)看，CaCl2用量為2 g時(shí)最高，用量4 g和6 g反而降低。筆者分析原因可能是過(guò)量的CaCl2一方面阻礙了中性氧化鋁的除脂效果，另一方面在脫樣品組織水分的同時(shí)帶出了蛋白、脂肪等雜質(zhì)，而回收率受樣品提取液中脂肪雜質(zhì)的影響很大。故從上層液體吹干時(shí)間和回收率這兩個(gè)因素考慮，CaCl2的適宜用量為2 g。

表1 不同用量CaCl2對(duì)吹干時(shí)間和回收率的影響Table1 The influence of various concentrations of CaCl2on drying time and recovery ratio

2.6 氧化劑

試驗(yàn)材料孔雀石綠膠體金快速檢測(cè)試劑板不能直接檢測(cè)隱性孔雀石綠，需要將隱性轉(zhuǎn)化為顯性。不同氧化劑對(duì)隱性孔雀石綠回收率的影響見圖6。

圖6 不同氧化劑對(duì)隱性孔雀石綠回收率的影響Fig.6 The influence of various oxidants on recovery ratio

由圖6可見，雙氧水、過(guò)氧化鉛和高錳酸鉀不能轉(zhuǎn)化隱性孔雀石綠為顯性孔雀石綠，10μL 1%高碘酸溶液和100μL 0.1%四氯苯醌的轉(zhuǎn)化率較好，根據(jù)回收率高低，選擇100μL 0.1%四氯苯醌為最適氧化劑。

2.7 方法的回收率和精密度

用本研究方法測(cè)定孔雀石綠和隱性孔雀石綠添標(biāo)鯽魚、南美白對(duì)蝦樣品，添加濃度分別為0.25、2、8μg/kg，測(cè)定的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。

3 小結(jié)

本研究對(duì)水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的提取技術(shù)進(jìn)行了研究，并采用免疫膠體金層析技術(shù)建立了水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的定量檢測(cè)方法。優(yōu)化后孔雀石綠提取液的pH為4.5，對(duì)甲苯磺酸濃度為0.06mol/L，凈化劑為2 g中性氧化鋁，脫水劑為2 g氯化鈣，氧化劑為100μL 0.1%四氯苯醌。該方法的線性范圍為0.25μg/L～8μg/L，線性系數(shù)0.996 1，孔雀石綠加標(biāo)回收率80.1%～89.6%，隱性孔雀石綠加標(biāo)回收率為66.9%～72.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.07%～8.14%。

表2 樣品添標(biāo)回收率和精密度Table2 The recovery ratio and precision after adding the standard solution

[1]Bergwerff A A,Kuiper R V,Scherpenisse P.Persistence of residues of malachite green in juvenile eels(Anguilla anguilla)[J].Aquaculture,2004,233(1/4):55-63

[2]孫滿義,楊賢慶,岑劍偉,等.水產(chǎn)品中孔雀石綠的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2009(2):312-315

[3]中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局,廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局,等.GB/T 19857-2005水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005

[4]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.GB/T 20361-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006

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[6]錢蓓蕾,王媛,蔡友瓊.孔雀石綠快速檢測(cè)試劑盒的比較研究以及在水產(chǎn)品監(jiān)控中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代漁業(yè)信息,2011,26(10):19-21

[7]曹慧,管驍,張小剛,等.水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)及殘留提取技術(shù)[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(11):100-103

Study on Rapid and Quantitative Detection for Malachite Green and Leucomalachite Green in Aquatic Product

SANG Li-ya1，ZHU Xiao-hua2，ZHENG Bai-qin3，DONG Li-xue3，SHAO Wei1，WANG Zhen-guo1
（1.Hangzhou Nankai Biotech Co.，Ltd.，Hangzhou，310022，Zhejiang，China；2.Freshwater Fisheries Research institute of Jiangsu Province，Nanjing，210017，Jiangsu，China；3.Tangshan animal husbandry and aquatic productsˊquality Monitoring Center，Tangshan，063000，Hebei，Chnia）

Using colloidal gold immunochromatography assay to detect the content of malachite green（MG）and leucomalachite green（LMG）in aquatic products，and study on sample pretreatment.The results showed that the linear range and the correlation coefficient R2of this method were0.25μg/L-8μg/Land 0.996 1；the optimal pH and p-toluenesulfonic acid concentration of extracting solution were 4.5 and 0.06mol/L；the optimal purifying agent，dehydrating agent and oxidant were neutral alumina，calcium chloride and chloranil；the recovery rate of MG and LMG were 80.1-89.6%and 66.9-72.9%，respectively，and the relative standard deviation was1.07%-8.14%.

Malachite Green；Leucomalachite Green；Aquatic Products；Colloidal Gold；Sample Pretreatment

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.025

2012-11-02

杭州市種子資金項(xiàng)目（20102431K62）

桑麗雅（1982—），女（漢），高級(jí)工程師，碩士，主要從事食品安全快速檢測(cè)試劑的開發(fā)。