蔡瑋紅，郭新東，萬渝平，羅海英，吳玉鑾，羅東輝，黃宇鋒

（1．廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州510110；2.成都市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，四川成都610041）

肉和肉制品中大腸桿菌的檢驗及計數(shù)

蔡瑋紅1，郭新東1，萬渝平2，羅海英1，吳玉鑾1，羅東輝1，黃宇鋒1

（1．廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州510110；2.成都市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，四川成都610041）

研究建立了肉和肉制品中大腸桿菌的檢驗及計數(shù)方法，分別對金黃色葡萄球菌等9種陰性菌株和1種陽性菌株（大腸埃希氏菌（ATCC25922））進(jìn)行了試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9種陰性菌株在纖維素乙酸酯膜上都沒有菌落生長，而陽性菌株大腸埃希氏菌（ATCC25922）在纖維素乙酸酯膜上的菌落吲哚反應(yīng)為陽性，試驗結(jié)果沒有出現(xiàn)假陽性或假陰性情況，方法準(zhǔn)確性較高，特異性強(qiáng)。

肉和肉制品；大腸桿菌；檢驗；計數(shù)

大腸桿菌（Escherichia coli.），分類于腸桿菌科，又名大腸埃希氏菌，是廣泛存在于人和溫血動物中，能夠在44.5℃發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC（靛基質(zhì)、甲基紅、VP試驗、檸檬酸鹽）生化試驗為＋＋－－或－＋－－的革蘭氏陰性桿菌。與人類疾病有關(guān)的大腸桿菌一般包括五種，即腸毒素性大腸桿菌（ETEC），致病性大腸桿菌（SPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC），侵襲性大腸桿菌（EIEC）和粘附性大腸桿菌（EAEC）。一些特殊血清型的大腸桿菌（例如大腸桿菌O157∶H7）對人類和動物具有病源性，這種效果在嬰兒以及家禽上的反映尤為明顯，受到大腸桿菌污染的食品被食用進(jìn)入人體后，可以引發(fā)痢疾、霍亂或者傷寒等腸道疾病甚至是嚴(yán)重的敗血癥，目前把這類大腸桿菌稱之為致病性大腸桿菌[1]。1982年美國首次報道了由EHECO157∶H7引起的出血性腸炎暴發(fā)；1989年加拿大發(fā)生了一起O157∶H7大腸桿菌感染爆發(fā)，在2000多位居民中，發(fā)病243人，發(fā)病率11.6%；2006年9月在美國許多州都發(fā)生了嚴(yán)重的因食用被污染的新鮮菠菜而導(dǎo)致食物中毒的病例，造成至少199人染病的病菌屬于大腸桿菌，2012年，北愛爾蘭首府貝爾法斯出現(xiàn)大腸桿菌疫情，確認(rèn)和疑似的總病例數(shù)已達(dá)170人。由此可見，因大腸桿菌引起的食品安全突發(fā)事件頻頻發(fā)生，研究開發(fā)精確的測量方法來檢測食品樣本是否被致病性大腸桿菌污染，具有重要意義。

肉和肉制品營養(yǎng)豐富，屬于人們?nèi)粘ＯM的大宗食品，由于衛(wèi)生環(huán)境污染，其也特別容易增殖有害細(xì)菌。加強(qiáng)對肉于肉制品中大腸桿菌的監(jiān)測，更屬于迫在眉睫的食品安全風(fēng)險預(yù)警范疇?；谝陨仙鐣枨蠛蛻?yīng)用前景[2]，本文以肉與肉制品為食品基質(zhì)，借鑒國際上肉和肉制品微生物學(xué)檢驗方面的先進(jìn)技術(shù)[3-8]，研究建立肉和肉制品中大腸桿菌的計數(shù)方法，以期為保障肉和肉制品質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

1 材料和試劑

1.1 儀器

MARK2厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)：荷蘭MARK公司；HVE-50高壓滅菌器：日本HIRAYAMA公司；NU-425-400E生物安全柜：美國NUAIRE公司；CX41RF-2顯微鏡：日本OLYMPUS公司；長波（365 nm）紫外燈（安裝有合適的濾光器以過濾波長小于310 nm的紫外光）。

1.2 試劑和材料

纖維素乙酸酯膜（孔徑大小為0.45μm～1.2μm，直徑85mm）；新鮮肉、冷凍肉、冷藏肉和部分肉制品購自廣州大型超市，部分肉制品來自生產(chǎn)企業(yè)；培養(yǎng)基和試劑購自廣東環(huán)凱公司；菌種購自廣東省微生物研究所。

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為礦物質(zhì)改良谷氨酸酯瓊脂，其成分為：谷氨酸鈉（6.35 g）、乳糖（10.0 g）、甲酸鈉（0.25 g）、L（-）-胱氨酸（0.02 g）、L（-）-天冬氨酸（0.024 g）、L（+）-精氨酸（0.02 g）、硫胺素（維生素B1）（0.001 g）、煙酸（0.001 g）、泛酸（維生素B3）（0.001 g）、硫酸鎂（MgSO4· 7H2O）（0.100 g）、檸檬酸鐵（3價）銨[至少15%的Fe（m/m）]（0.010 g）、氯化鈣（CaCl2·2H2O）（0.010 g）、磷酸氫二鉀（0.90 g）、氯化銨（2.5 g）、瓊脂（12 g～18 g，取決于瓊脂的膠強(qiáng)度）、蒸餾水（1 000mL）。

配制滅菌：用蒸餾水溶解氯化銨，再加入其它成分，煮沸溶解。調(diào)節(jié)pH，使其滅菌后在25℃時pH為6.7。轉(zhuǎn)移100mL培養(yǎng)基至適量容器中，于高壓蒸汽滅菌器中121℃滅菌10min。

平板制備：待培養(yǎng)基在水浴箱中冷卻至47℃時，傾注12mL～15mL培養(yǎng)基至無菌有蓋平皿中，冷卻凝固。臨用前，小心干燥這些瓊脂平板（例如放在50℃的培養(yǎng)箱或烘箱中），移開皿蓋，并倒放平皿，直至培養(yǎng)基表面的水滴全部消失。這些瓊脂平板在0℃至5℃可存放一周。

1.2.2 選擇性培養(yǎng)基

選擇性培養(yǎng)基為胰蛋白胨膽鹽瓊脂，其成分為：胰蛋白胨（20.0 g）、膽汁鹽（精煉）（1.5 g）、瓊脂（12 g～18 g）、蒸餾水（1 000mL）。

配制滅菌：將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解。調(diào)節(jié)pH，使其滅菌后在25℃時的pH為7.2。移取100mL培養(yǎng)基至適量容器，于高壓蒸汽滅菌器中121℃滅菌15min。

平板制備：待瓊脂在水浴箱中冷卻至47℃時，傾注12mL～15mL培養(yǎng)基至無菌有蓋平皿中，冷卻凝固。臨用前，小心干燥這些瓊脂平板（例如放在50℃的培養(yǎng)箱或烘箱中），移開皿蓋，并倒放平皿，直至培養(yǎng)基表面的水滴都消失為止。無需進(jìn)一步干燥。這些平板在0℃～5℃可保存4 d。

1.2.3 吲哚檢測試劑

吲哚檢測試劑的成分為：對二甲氨基苯甲醛（5 g）；鹽酸（HCl，1mol/L）：100mL。

配制：將對二甲氨基甲醛加入鹽酸中溶解，常溫保存，在1個月內(nèi)使用。

1.3 計數(shù)方法原理

大腸桿菌的檢測包括三個連續(xù)的步驟。

1.3.1 復(fù)壯

接種一定量初始懸浮液至覆蓋于礦物質(zhì)改良谷氨酸酯瓊脂的纖維素乙酸酯膜上，37℃培養(yǎng)4 h。

1.3.2 分離

將復(fù)壯階段覆蓋于礦物質(zhì)改良谷氨酸酯瓊脂上的纖維素乙酸酯膜轉(zhuǎn)移至胰蛋白胨膽鹽瓊脂上，44℃培養(yǎng)18 h～20 h。

1.3.3 檢測

由菌落的吲哚產(chǎn)物表明膜上大腸桿菌的存在。標(biāo)記每個皿蓋以進(jìn)行鑒定。

1.3.4 計數(shù)

計算合適的稀釋水平下纖維素乙酸酯膜上吲哚試驗陽性的菌落數(shù)，得出每克或每毫升樣品中大腸桿菌的數(shù)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測過程注意事項

2.1.1 復(fù)壯

以無菌操作方法，用無菌鑷子將纖維素乙酸酯膜放至兩個表面已經(jīng)干燥的谷氨酸酯瓊脂平板上，小心操作以避免膜的下方形成氣泡，用無菌涂布棒輕輕地?fù)崞侥?；用無菌刻度吸管取1mL初始懸浮液至每張膜的中心。用無菌涂布棒將接種液均勻地涂布在整張膜的表面，同時避免溢出膜面；使用另一支無菌刻度吸管，接種1mL進(jìn)一步稀釋的懸浮液至另外的膜上。從試樣的制備至接種膜上的時間間隔不應(yīng)超過45min。水平放置接種的平板，室溫保持約15min，直至接種液被完全吸收進(jìn)膜中。將平板的膜/瓊脂面朝上放進(jìn)恒溫培養(yǎng)箱，35℃～37℃培養(yǎng)（4±0.5）h。這個步驟可使在冷凍、冷藏或干燥以及加熱或生化加工條件下受損的大腸桿菌恢復(fù)活力，也可使高濃度、可發(fā)酵的糖類擴(kuò)散。若樣品中存在這些糖類，在分離階段這些糖類將干擾吲哚的產(chǎn)生。

2.1.2 轉(zhuǎn)移至選擇性培養(yǎng)基

用無菌鈍角鑷子，將膜從礦物質(zhì)改良谷氨酸酯瓊脂轉(zhuǎn)移至胰蛋白胨膽鹽瓊脂，保持膜的接種面朝上；使?jié)駶櫟哪ぞo貼在瓊脂表面，避免產(chǎn)生氣泡。不要使用涂布棒，因為涂布會使存在的菌落分散，以致得出錯誤的偏高數(shù)值；保持膜/瓊脂面朝上，將平板放進(jìn)恒溫培養(yǎng)箱，44℃培養(yǎng)18 h～24 h。堆疊平板數(shù)不要超過3個。

2.1.3 檢測

將皿蓋倒放，加入2mL吲哚檢測試劑。用鑷子從相應(yīng)的瓊脂表面夾起膜，放入吲哚檢測試劑。必要時傾斜蓋子以使整張膜的表面被吲哚試劑潤濕。5min后用移液管吸去多余試劑。將膜放在紫外燈下照射30min，吲哚試驗陽性的菌落為粉紅色。

2.1.4 檢測與計數(shù)

選擇膜上粉紅菌落數(shù)在15至150之間的膜，計算膜上吲哚試驗陽性（粉紅）菌落的數(shù)量。若對應(yīng)于一定稀釋度的2張膜上的粉紅菌落在15至150之間，計算這兩張膜上菌落數(shù)量的算術(shù)平均值：若數(shù)值小于100，修約成最近的5倍數(shù)值；若數(shù)值大于100并且以5為尾數(shù)，修約成最近的20倍數(shù)值；若數(shù)值大于100并且不以5為尾數(shù)，修約成最近的10倍數(shù)值；保留兩位有效數(shù)字，修約后的數(shù)值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，得到每克產(chǎn)品中大腸桿菌的數(shù)值，用在1.0和9.9之間的數(shù)字乘以恰當(dāng)?shù)?0次冪來表達(dá)結(jié)果。

2.2 菌株試驗結(jié)果分析

分別對9種陰性菌株（金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、枯草芽孢桿菌（CMCC（B）63501）、銅綠假單胞菌（ATCC 9027）、惡臭假單胞菌（廣臨檢-10）、傷寒沙門氏菌（CMCC（B）50071）、痢疾志賀氏菌（CMCC（B）51252）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（CMCC（B）54002）、白色念珠菌（ATCC 10231）和副溶血性弧菌（VPL4-90））和1種陽性菌株（大腸埃希氏菌（ATCC25922））進(jìn)行了試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9種陰性菌株在纖維素乙酸酯膜上都沒有菌落生長；而陽性菌株大腸埃希氏菌（ATCC25922）在纖維素乙酸酯膜上的菌落吲哚反應(yīng)為陽性。試驗結(jié)果未發(fā)現(xiàn)假陽性或假陰性，說明方法準(zhǔn)確性高，特異性強(qiáng)。

2.3 實際樣品分析

2.3.1 冷藏、冷凍及新鮮肉的試驗結(jié)果分析

測試了豬、牛羊和雞肉（冷藏、冷凍和新鮮肉）的表層、深層樣品的大腸桿菌的情況，結(jié)果見表1。

表1 新鮮肉、冷藏和冷凍的檢驗結(jié)果Table1 The result of fresh meat，frozen meat and cold meat

從表1可以看出，新鮮肉、冷藏和冷凍的表層樣品由于在屠宰、貯藏和運輸過程中較易受污染，大腸桿菌的檢出較多。而深層樣品由于較難受外界的污染，而且健康動物內(nèi)部組織本身是無菌的，所以大腸桿菌的檢出較少，基本小于10CFU/g。

2.3.2 肉制品的實驗結(jié)果分析

測試了30種肉制品中大腸桿菌的情況，包括10種包裝的熟肉制品（鹽焗雞爪等）、6種非定量包裝的熟肉制品（烤雞腿等）、8種香腸類（牛肉熱狗腸等）、4種肉松和肉干類（豬肉松等）、4種臘制品（臘肉等）和4種預(yù)加工肉制品（牛肉丸等）。從試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各種肉制品中大腸桿菌的檢出量都較低，說明肉制品經(jīng)過了加熱、包裝等一系列的加工處理，而且一般的肉和肉制品產(chǎn)品都會添加一些抑制微生物生長的防腐劑類物質(zhì)，大腸桿菌的檢出量較低是合理的。

3 結(jié)論

肉和肉制品營養(yǎng)物質(zhì)豐富多樣，是人們?nèi)粘５闹饕称罚策m于各類細(xì)菌的繁殖。目前，國內(nèi)對肉和肉制品的微生物檢驗主要還是依據(jù)GB 2726《熟肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的項目進(jìn)行檢驗，并不能全面、細(xì)致地分析肉和肉制品中大腸桿菌的污染情況。因此，本方法在借鑒國際上肉和肉制品微生物學(xué)檢驗方面的先進(jìn)技術(shù)的基礎(chǔ)上，以肉與肉制品中的大腸桿菌為研究對象，建立了肉和肉制品中大腸桿菌的計數(shù)方法，實驗表明，本方法的準(zhǔn)確度、靈敏度和特異性都能較好地滿足肉和肉制品中大腸桿菌的檢測和計數(shù)，準(zhǔn)確可行。

[1]VogtR L,Dippold L.Escherichia coliO157:H7Outbreak Associated with Consumption of Ground Beef,June-July 2002[J].Public health reports,2005,120(2):174-178

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2726-2005熟肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005

[3]International Organization for Standardization.ISO 6391:1997Meat and meat products—Enumeration of Escherichia coli—Colonycount technique at 44℃ using membranes[S].Switzerland,1997

[4]International Organization for Standardization.ISO 17604:2003Microbiology of food and animal feeding stuffs—Carcass sampling for microbiological analysis[S].Switzerland,2003

[5]International Organization for Standardization.ISO 6887-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs—Preparation of test samples,initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination—Part1:General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions[S].Switzerland,1999

[6]International Organization for Standardization.ISO 6887-2:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs—Preparation of test samples,initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination—Part2:Specific rules for the preparation of meat and meat products[S].Switzerland,1999

[7]International Organization for Standardization.ISO 7218:1996 Microbiology of food and animal feeding stuffs—General rules for microbiological examinations[S].Switzerland,1996

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.38-2012食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸埃希氏菌計數(shù)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2012

Examination and Enumeration of Escherichia coli for Meat and Meat Products

CAI Wei-hong1，GUO Xin-dong1，WAN Yu-ping2，LUO Hai-ying1，WU Yu-luan1，LUO Dong-hui1，HUANG Yu-feng1
（1.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou 510110，Guangdong，China；2.Chengdu Product Quality Supervision and Inspection Institute，Chengdu 610041，Sichuan，China）

Meat and meat products are the main food in peopleˊs daily life due to the high quality nutrients of them. However， they are also liable to be contaminated by some kinds of harmful microbe， especially Escherichia coli. In this work， the examination and enumeration method of Escherichia coli for meat and meat products was established， and then 9 negative bacterial strains， such as staphylococcus aureus， and 1 positive bacterial strain [Escherichia coli （ATCC25922）] were examined. The results found that there was no bacterial colony growing on the cellulose acetate membrane for 9 negative bacterial strains， while the indole reaction for Escherichia coli is positive. More importantly， there were no false-positive and false-negative situations in the experimental results.This method not only has a high accuracy， but also has a strong specificity.

meat and meat products；Escherichia coli；examination；enumeration

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.020

2013-12-05

四川省科技支撐計劃項目（2012GZ0118）；廣州市科技計劃項目（[2011]233-34）

蔡瑋紅（1964—），女（漢），高級工程師，本科，研究方向：食品及食品相關(guān)產(chǎn)品分析技術(shù)研究。