劉永吉，劉國(guó)凌，黃前娣，郭紅輝

（韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化纖維素酶輔助提取黑米花色苷研究

劉永吉，劉國(guó)凌，黃前娣，郭紅輝*

（韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法對(duì)纖維素酶輔助乙醇浸提黑米皮花色苷提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究。選擇酶解溫度、酶用量和酶解時(shí)間為自變量，花色苷提取量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，研究各自變量及其交互作用對(duì)花色苷提取率的影響。利用Design Expert7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型。結(jié)果表明，纖維素酶輔助提取黑米花色苷的優(yōu)化工藝條件為：加酶量為2.0%，酶解溫度為38.7℃，酶解時(shí)間為128.8min，料液比為1∶10，浸提時(shí)間為40min，浸提溫度為50℃，乙醇浸提液濃度為80%，在此條件下，黑米皮中花色苷的提取量理論值達(dá)21.9mg/g。

黑米；花色苷；纖維素酶；響應(yīng)曲面法；Box-Behnken設(shè)計(jì)

花色苷是廣泛存在于自然界的一種植物多酚，屬于水溶性黃酮花色素甙類化合物，大多數(shù)植物花朵及果實(shí)所呈現(xiàn)的豐富色彩都與花色苷類物質(zhì)有關(guān)[1]?；ㄉ疹惿爻速x予植物豐富的色彩外，大量的研究證實(shí)花色苷還具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂、抗突變及抗腫瘤等生理保健作用[2]。此外，花色苷作為一種較為安全的天然色素，在食品工業(yè)也顯示出了廣闊的應(yīng)用前景[3]。黑米是一種花色苷含量較高的谷物，來(lái)源廣泛，然而自然狀態(tài)下，花色苷與其他輔助物質(zhì)（共色素、糖類、氨基酸等）共存，難以提取。因此，很有必要對(duì)黑米花色苷的分離和提取條件進(jìn)行優(yōu)化研究。

1 材料及方法

1.1 材料

用精米機(jī)磨取黑米糙米外層約10%種皮得到黑米皮作為提取原料。纖維素酶：日本W(wǎng)ako公司生產(chǎn)（活力≥10U/mg）；無(wú)水乙醇、鹽酸、氯化鉀和乙酸鈉均為市售分析純。主要儀器設(shè)備有電熱恒溫水浴箱、干燥箱、電子分析天平、高速臺(tái)式離心機(jī)、數(shù)顯酸度計(jì)和可見分光光度計(jì)等。

1.2 方法

1.2.1 乙醇法提取黑米皮花色苷條件的優(yōu)化

稱取0.2 g黑米皮，分別選擇不同的浸提時(shí)間、溫度、乙醇濃度和料液比等提取條件，經(jīng)浸提、離心、定容、靜置后用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度并計(jì)算其含量[4]。

根據(jù)T Fuleki的研究，結(jié)合比耳定律公式A= εbc，采用如下公式計(jì)算黑米皮中花色苷提取量[5]：

式中：X為黑米皮花色苷含量，（mg/g）；ΔT為吸光值；V為稀釋體積，L；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量（M=449.2）；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)（ε=26 900）；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.2 酶法輔助提取黑米皮花色苷條件的優(yōu)化

根據(jù)上述研究建立的乙醇浸提最優(yōu)條件，在浸提之前，加入纖維素酶輔助提取，選擇加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間作為試驗(yàn)因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定最佳酶解條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇對(duì)響應(yīng)值（花色苷提取量）有顯著影響的因素。利用Design Expert7.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，每一變量的低、中、高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，模型選用二次方程：

其中Y為響應(yīng)值，β0、β1、β2、β3、β12、β13、β23、β11、β22、β33為方程系數(shù)，X1、X2、X3為自變量編碼值。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇法提取黑米皮花色苷的最優(yōu)條件單因素正交試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 乙醇法提取黑米皮花色苷正交因素水平設(shè)計(jì)Table1 Orthogonal array of anthocyanin extracted from black rice pericarp by ethanol solutions

對(duì)浸提時(shí)間、浸提溫度、浸提液濃度、料液比進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，方差分析見表2，結(jié)果表明，D高度顯著，其次分別為C、B、A，通過(guò)比較Kij值，可確定各因素的最優(yōu)水平為A2、B2、C3、D1，最優(yōu)水平組合A2B2C3D1。即浸提時(shí)間為40min，浸提溫度為50℃，浸提液濃度為80%，料液比為1∶10，此時(shí)，黑米花色苷的提取量為16.5mg/g。

表2 乙醇法提取黑米皮花色苷正交試驗(yàn)方差分析Table2 Variance analysis of anthocyanin extracted by ethanol solutions

2.2 纖維素酶輔助提取黑米皮花色苷的最優(yōu)條件

2.2.1 單因素試驗(yàn)

各因素對(duì)花色苷提取量的影響見圖1。

圖1 不同酶解條件對(duì)黑米皮花色苷提取量的影響Fig.1 Influence of enzymolysis conditions on anthocyanin yield from black rice pericarp

最優(yōu)酶解條件為加酶量為2.0%時(shí)黑米皮花色苷提取量基本達(dá)到最大值，酶解溫度為40℃，酶解時(shí)間為120min。

2.2.2 響應(yīng)曲面法分析因素的選取及分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案[6]，分別以加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)應(yīng)3個(gè)獨(dú)立變量X1、X2、X3，并以-1、0、1分別代表變量的水平。實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼見表3，表中X1、X2、X3為變量的編碼值，黑米花色苷的提取量Y為響應(yīng)值見表4，利用Design Expert7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多元二次回歸模型：

表3 試驗(yàn)因素水平及編碼Table3 Experimental factors，levels and codes

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案Table4 Box-Behnken design arrangement

回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)見表5，模型一次項(xiàng)X1、X3較顯著，X2不顯著；二次項(xiàng)X22、X32極顯著，X12不顯著；交互項(xiàng)X1X3、X2X3顯著，X1X2不顯著。表明各因素對(duì)花色苷提取量的影響不是簡(jiǎn)單線性關(guān)系。

表5 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table5 Significance test of the regression model coefficients

2.2.3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸分析的結(jié)果，作出模型的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，結(jié)果見圖2～圖4。

當(dāng)酶解時(shí)間為120min時(shí)，加酶量與酶解溫度對(duì)花色苷提取量的影響見圖2，花色苷提取量隨著加酶量的增加而增大，隨著酶解溫度先增大后減小。

圖2 加酶量與酶解溫度對(duì)花色苷提取量影響的響應(yīng)面圖（a）及等高線圖（b）Fig.2 Response surface plot and contour map of the anthocyanin yield as affected by enzyme amounts and reaction temperature

圖3 加酶量與酶解時(shí)間對(duì)花色苷提取量影響的響應(yīng)面圖（a）及等高線圖（b）Fig.3 Response surface plot and contour map of the anthocyanin yield as affected by enzyme amounts and reaction time

圖4 酶解溫度與酶解時(shí)間對(duì)花色苷提取量影響的響應(yīng)面圖（a）及等高線圖（b）Fig.4 Response surface plot and contour map of the anthocyanin yield as affected by zymolysis time and temperature

當(dāng)酶解溫度為40℃時(shí)，加酶量與酶解時(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響見圖3，花色苷提取量隨著加酶量的增大而增大，而隨著酶解時(shí)間先增大后減小。酶解時(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響較大，表現(xiàn)為較陡的曲線；加酶量對(duì)花色苷提取量的影響較小，表現(xiàn)為較平緩的曲線。

當(dāng)加酶量為1.75%時(shí)，酶解溫度與酶解時(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響見圖4，花色苷提取量隨著酶解溫度和酶解時(shí)間的增大先增大后減小，酶解時(shí)間對(duì)黑米花色苷提取量的影響較大，表現(xiàn)為較陡的曲線；酶解溫度對(duì)黑米花色苷的提取量影響較小，表現(xiàn)為較平緩的曲線。

利用Design Expert 7.0軟件可以確定最佳點(diǎn)的值：加酶量為2.0%，酶解溫度為38.7℃，酶解時(shí)間為128.8min，在此條件下，花色苷的提取量理論值達(dá)21.9mg/g。

3 結(jié)論

根據(jù)上述兩種方法的最佳提取量可知，利用纖維素酶輔助提取黑米中的花色苷比乙醇法提取的花色苷增加率為：A=[（21.9-16.5）/21.9]×100%=24.7%。

因此，利用纖維素酶輔助提取黑米中的花色苷比乙醇法提取的花色苷的量大，其提取效率增加24.7%。纖維素酶作用于黑米皮細(xì)胞壁，使細(xì)胞壁軟化、膨脹及崩潰，從而促進(jìn)花色苷的溶出，提高黑米花色苷的提取量。

[1]王璐,王振宇,李小雨.花色苷的分離鑒定及生物活性綜述[J].食品工業(yè)科技,2012,33(3):395-399

[2]郭紅輝,凌文華.黑米花色苷研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2008, 29(3):133-135

[3]張晴．黑米色素提取精制工藝的研究[J]．青島大學(xué)學(xué)報(bào),2000,15 (2):24-26

[4]劉洪海,張曉麗,杜平,等.pH示差法測(cè)定煙73葡萄中花青素含量[J].食品添加劑,2009,34(9):111-117

[5]楊兆艷.pH示差法測(cè)定桑椹紅色素中花青素含量的研究[J].食品科技,2007,23(4):201-203

[6]李曉軍,潘宏利,陳花,等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲輔助提取金銀花總黃酮[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2009,39(2):82-90

Cellulase-assisted Extraction of Anthocyanins from Black Rice and its Optimization by Response Surface Method

LIU Yong-ji，LIU Guo-ling，HUANG Qian-di，GUO Hong-hui*
（Henry Fok School of Food Science and Engineering，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）

In this study， we used the response surface method on the base of single factor test， to optimize the extract process of cellulase-assisted extraction of anthocyanins from black rice. The enzymes dosage， enzymolysis time and temperature are studied with Box -Behnken design， the interactive effect on the influence of anthocyanins extraction was also predictive model of polynomial quadratic equation is by Design Expert 7.0 software. We chose the best solution as follows： 2.0 % adding amount of enzyme， enzymolysis time of 128.8 min at 38.7℃， solid-liquid ration for 1 ∶ 10， extracted for 40 min at 50 ℃ in 80 % ethanol solution. Under the optimized condition， the predicted extraction rate of the anthocyanins from the black rice pericarp is 21.9 mg/g.

black rice；anthocyanins；cellulose；reponse surface methodology；Box-Behnken design

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.007

2013-03-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81172655）；廣東省高等學(xué)校高層次人才項(xiàng)目（2011-128）

劉永吉（1983—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品生物活性成分。

*通信作者：郭紅輝（1977—），男（漢），教授，博士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。