肖付剛，孫軍濤，王德國

（許昌學院食品與生物工程學院，河南許昌461000）

苦瓜籽黃酮對油脂的抗氧化研究

肖付剛，孫軍濤，王德國

（許昌學院食品與生物工程學院，河南許昌461000）

用超聲波輔助法提取苦瓜籽中總黃酮，應用響應面法優(yōu)化了提取條件。結果表明，最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)72.22%，超聲提取時間38.67min，液料比為42.22mL/g，此條件下黃酮提取率達到3.89%。油脂抗氧化實驗表明，苦瓜籽黃酮對花生油和芝麻油均具有抗氧化作用（以過氧化值為例），對芝麻油的抗氧化活性優(yōu)于BHA，對花生油的抗氧化活性比BHA稍差。

苦瓜籽；黃酮；響應面實驗；超聲波輔助提取法；抗氧化活性

黃酮也稱黃堿素，廣泛存在于自然界，特別是植物中，由于最先發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物都具有一個酮式羰基結構，又呈黃色或淡黃色，故稱黃酮[1-2]。黃酮具有多種生物活性，它的生理作用一直倍受人們關注。20世紀初中期發(fā)現(xiàn)其具有VC活性和抗油脂氧化活性，80年代以后，對其研究開始轉向對活性氧自由基的清除及對老年病的防治功能上。許多研究已經(jīng)證實，黃酮具有抗氧化、抗菌[3]和抗疲勞[4]、清除自由基[5]等作用。黃酮具有的藥理活性和醫(yī)學價值，使其在醫(yī)藥、食品領域有廣闊的應用前景。

苦瓜籽為苦瓜的種子，苦甘、無毒[6]?？喙献阎泻胸S富的活性物質(zhì)，如VC、類胡蘿卜素和黃酮等。關于苦瓜籽中生理功能成分研究主要集中在多肽、甙等[7-9]，少見關于黃酮的報道。本試驗選用乙醇作為提取劑，以超聲波輔助法提取苦瓜籽中的黃酮類物質(zhì)，為后續(xù)研究其抗氧化、抑菌等提供物質(zhì)基礎?？喙献阎竞扛?，會增加提取物中脂溶性物質(zhì)的含量，而影響黃酮類物質(zhì)的純度，所以本試驗先采用索氏提取法脫去苦瓜籽中的脂肪，然后采用超聲波輔助提取法提取苦瓜籽中的黃酮類物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

苦瓜：市售；花生油和芝麻油：市售新鮮壓榨；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純；蘆丁對照品（含量≥98%）：上海生工生物有限公司。

752型紫外可見分光光度計：上海光學儀器廠；SK8210LHC超聲清洗儀：上?？茖С晝x器有限公司；BS124S電子分析天平：德國賽多利斯集團；HX-100型高速中藥粉碎機：浙江省永康市溪岸五金藥具廠；LGJ-10真空冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠有限公司。

1.2 苦瓜籽黃酮的提取流程

苦瓜→苦瓜籽→烘干→粉碎過篩→索氏脫脂→乙醇溶液超聲提取→離心分離→減壓蒸餾→真空冷凍干燥→苦瓜籽總黃酮

1.3 蘆丁標準溶液的配制與標準曲線繪制

以蘆丁為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉體系絡合化學吸光法測定總黃酮含量。參考文獻[10]的方法操作，測得蘆丁標準溶液在511 nm處有最大吸收，以蘆丁溶液濃度（mg/mL）為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到蘆丁標準曲線的回歸方程為Y=9.979X-0.005 9，R2=0.998 9，標準曲線在0mg/mL～0.05mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

1.4 苦瓜籽黃酮提取的單因素實驗、響應面實驗

在文獻的基礎上，首先擬定乙醇體積分數(shù)、料液比和提取時間進行單因素實驗。在單因素實驗的基礎上，應用Design Expert7.0軟件，利用Box-Behnken設計原理進一步進行3因素3水平的響應面分析試驗確定最佳工藝參數(shù)。

1.5 苦瓜籽黃酮的油脂抗氧化實驗

苦瓜籽黃酮對油脂的抗氧化試驗采用Schaal烘箱法[11]?；ㄉ秃椭ヂ橛蛢煞N油樣，按0.5%分別加入提取的苦瓜籽黃酮和BHA，并設空白對照。按GB/T 5009.37-2003《食用植物油衛(wèi)生標準分析方法》的方法每3天測定各油樣的過氧化值[12]。

2 結果與討論

2.1 乙醇濃度對苦瓜籽黃酮提取率的影響

乙醇濃度對苦瓜籽黃酮提取率的影響如表1。實驗條件：液料比為40mL/g，超聲提取時間30min。

表1 乙醇濃度對苦瓜籽黃酮提取率的影響Table1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids from bitter melon seeds

結果顯示，隨著乙醇濃度的增加，苦瓜籽黃酮的提取率逐漸增大，乙醇濃度大于70%時，增長趨緩，從節(jié)省原料方面考慮，最適乙醇濃度選擇70%。

2.2 液料比對苦瓜籽黃酮提取率的影響

液料比對苦瓜籽黃酮提取率的影響如表2。實驗條件：乙醇濃度70%，超聲提取時間30min。

表2 液料比對苦瓜籽黃酮提取率的影響Table2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids from bitter melon seeds

結果顯示，液料比20mL/g～30mL/g時提取率增加的幅度較大，30mL/g～40mL/g時提取率增加幅度明顯放緩，當超過40mL/g時，提取率反而減少。因此，從提取效果、經(jīng)濟成本等方面綜合考慮，選擇液料比40mL/g為宜。

2.3 超聲提取時間對苦瓜籽黃酮提取率的影響

超聲提取時間對苦瓜籽黃酮提取率的影響如表3。實驗條件：乙醇濃度70%，液料比40mL/g。

表3 超聲提取時間對苦瓜籽黃酮提取率的影響Table3 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids from bitter melon seeds

結果顯示，隨著超聲時間的增加，黃酮的提取率呈上升趨勢。超聲時間較短時，由于苦瓜籽中的黃酮沒有與溶劑充分接觸，提取率較低；但當超聲時間大于40min時，提取率增長趨緩。這是因為有效成分濃度差是超聲波提取的主要推動力，在提取初期，有效成分濃度差較大，故提取速率較快；當超聲時間較長時，有效成分濃度差較小且黃酮的提取接近完全，故提取速率減慢。所以，綜合考慮到能源消耗和提取效率等因素，可以選定最佳超聲提取時間為40min。

2.4 響應面試驗結果與分析

綜合單因素試驗的結果，利用Box-Behnken設計原理進一步進行3因素3水平的響應面分析試驗，試驗因素水平編碼見表4，試驗分析方案及結果見表5。

表4 Box-Behnken設計試驗因素水平編碼表Table4 Factors and levels table of Box-Behnken test

應用Design Expert7.0軟件進行多元回歸分析，得到以苦瓜籽中黃酮含量（y）為目標的二次多項式回歸方程如下：

式中：液料比（x1）、乙醇體積分數(shù)（x2）和超聲時間（x3）在設計中均經(jīng)量綱線性編碼處理，故方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映了各因素對指標值的影響程度，系數(shù)的正負反映了影響的方向。

對超聲提取苦瓜籽中黃酮的數(shù)學模型進行方差分析，以檢驗方程的有效性和各因子的偏回歸系數(shù)，結果見表6。

表5 響應面試驗結果與分析Table5 Results and analysis of Response Surface Methodology（RSM）

表6 方差分析表Table6 Table of analysis of variance

從表6可以看出，一次項中x1、x2的回歸系數(shù)極顯著，說明料液比和乙醇體積分數(shù)對黃酮得率有極顯著影響；回歸方差分析顯著性檢驗結果表明，該模型回歸顯著，且失擬項不顯著，說明該方程對試驗擬合較好。

采用軟件中Optimization的Numerical功能，在模型濃度范圍內(nèi)選擇最低點為出發(fā)點，使用最大值優(yōu)化，得到超聲輔助提取苦瓜籽黃酮的理論最佳工藝條件為：液料比42.22mL/g，乙醇體積分數(shù)72.22%，超聲時間38.67min，該條件下苦瓜籽總黃酮提取率為3.89%。

2.5 抗氧化試驗結果與分析

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)繪制分別加入苦瓜籽黃酮、BHA以及空白對照的花生油（圖1）和芝麻油（圖2）的過氧化值變化曲線。

圖1 花生油的抗氧化性試驗結果Fig.1 Results of peanut oil oxidation resistance test

圖2 芝麻油的抗氧化性試驗結果Fig.2 Results of sesame oil oxidation resistance test

由圖1和圖2可知：苦瓜籽黃酮、BHA對花生油和芝麻油都有抗氧化效果。對芝麻油苦瓜籽黃酮比BHA的抗氧化效果好，但對花生油卻比BHA的抗氧化效果稍差。原因可能是苦瓜籽黃酮為粗提物，并且在油中的溶解性不是很好，因此影響了抗氧化效果。即使在未完全溶解的情況下對芝麻油的抗氧化效果仍比BHA的好，說明苦瓜籽黃酮有很好的抗氧化效果。BHA是人工合成抗氧化劑，對人體存在一定的安全隱患，苦瓜籽黃酮為天然抗氧化劑，無毒副作用，因此苦瓜籽黃酮的應用前景廣闊。

3 結論

通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設計以及響應面分析法，對超聲提取苦瓜籽總黃酮的工藝進行優(yōu)化，得出的最佳工藝條件為液料比42.22mL/g，乙醇體積分數(shù)72.22%，超聲時間38.67min，該條件下苦瓜籽總黃酮提取率為3.89%。并得到苦瓜籽總黃酮提取率與各因素變量的二次回歸方程模型，該模型回歸顯著，對試驗擬合較好，有一定應用價值。

油脂抗氧化實驗表明，苦瓜籽黃酮對花生油和芝麻油均具有抗氧化作用（以過氧化值為例），對芝麻油的抗氧化活性優(yōu)于BHA，對花生油的抗氧化活性比BHA稍差。

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Study on Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids from Bitter Melon Seed

XIAO Fu-gang，SUN Jun-tao，WANG De-guo
（School of Food and Bioengineering，Xuchang University，Xuchang461000，Henan，China）

Ultrasonic-assisted extraction was applied to extract flavonoids from bitter melon seeds. Response surface methodology （RSM） was applied to optimize the extraction conditions. The result showed that the optimal extraction conditions of ethanol concentration， extraction time and liquid-to-material ratio were 72.22%， 38.67min and 42.22 mL/g， respectively. Under these conditions， the extraction rate of flavonoids was 3.89 %. Result of antioxidation experiment in oil suggested that flavonoids from bitter melon seeds had antioxidant effects on both peanut oil and sesame oil， and the antioxidant activity to sesame oil was better than BHA， but which to peanut oil was slightly lower than BHA.

bitter melon seeds；flavonoids；response surface methodology（RSM）；ultrasonic-assisted extraction；antioxidation activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.006

2014-01-13

國家自然科學青年基金（21107090）；河南省高等學校青年骨干教師資助計劃（2013GGJS-168）；許昌學院教研項目（02013128）

肖付剛（1978—），男(漢)，副教授，博士，研究方向：糧油食品，食品質(zhì)量安全。