余茜煒，向夢雄，左 樂，蔡 俊，王常高

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430068)

β-胡蘿卜素是聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織一致認(rèn)定的A類營養(yǎng)色素，不僅是人體內(nèi)維生素A的重要來源，且具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)免疫等功能，在醫(yī)藥、食品著色及營養(yǎng)強(qiáng)化、日用化妝品及飼料添加劑等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。目前，市場上的β-胡蘿卜素產(chǎn)品主要有化學(xué)合成品和天然產(chǎn)品2種類型。天然β-胡蘿卜素因其功能性強(qiáng)、安全性好及生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)而日益受到人們的青睞[2]。發(fā)酵法是目前生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的主要途徑，在可合成β-胡蘿卜素的微生物中，三孢布拉氏霉無論是生物量(可達(dá)50 g干菌體/L)，還是菌體細(xì)胞中β-胡蘿卜素含量(可達(dá)菌體干重的1%～5%)都是最理想的，已成為目前國內(nèi)外研究和生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的主要菌種[3]。

湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室近年來一直致力于β-胡蘿卜素的發(fā)酵生產(chǎn)研究，前期已完成發(fā)酵條件優(yōu)化等方面的研究[4]。由于β-胡蘿卜素是一種脂溶性很強(qiáng)的胞內(nèi)產(chǎn)物，因此如何將β-胡蘿卜素從三孢布拉氏霉菌絲體中提取出來并進(jìn)行不同程度的分離純化也是發(fā)酵法生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的關(guān)鍵技術(shù)問題。筆者主要對(duì)三孢布拉氏霉菌絲體中β-胡蘿卜素提取的溶劑種類及條件進(jìn)行了初步的摸索研究，以期為今后的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供一定的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1材料供試菌絲體是湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采用100 L發(fā)酵罐利用三孢布拉氏霉正、負(fù)菌株結(jié)合發(fā)酵培養(yǎng)所得。新鮮菌絲洗凈后在50 ℃下真空干燥24 h得干菌絲體。干菌絲體采用氣流式超微粉碎機(jī)粉碎得干菌粉。該試驗(yàn)研究均為同一罐發(fā)酵所得菌絲體。

試驗(yàn)所用的無水酒精、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、正己烷和石油醚(60～90 ℃沸程)均為分析純。

1.2β-胡蘿卜素的提取及提取率計(jì)算精確稱取0.1 g的干菌粉，加入一定體積的各種不同溶劑，在不同的溫度和時(shí)間下進(jìn)行浸提，然后離心(8 000 r/min，5 min)，取上清液用浸提時(shí)所用的相應(yīng)溶劑進(jìn)行適當(dāng)稀釋，測定其在波長450 nm下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出浸提稀釋液中β-胡蘿卜素的濃度，再根據(jù)稀釋倍率，浸提時(shí)所用溶劑的體積及干菌粉的質(zhì)量計(jì)算出β-胡蘿卜素的提取得率。

提取得率=nCV/m(mgβ-胡蘿卜素/g干菌體)

式中，n為浸提液的稀釋倍率；C為浸提稀釋液中β-胡蘿卜素的濃度；V為浸提時(shí)所用溶劑的體積；m為干菌粉的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線精確稱取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)，用60～90 ℃沸程的石油醚溶解并稀釋成一系列不同濃度，分別測定其在波長450 nm下的吸光度。以β-胡蘿卜素的濃度為橫坐標(biāo)，以各自的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2溶劑種類對(duì)β-胡蘿卜素提取得率的影響精確稱取干菌粉0.1 g，加入1.5 ml的不同溶劑，在40 ℃下浸提2 h，分別測定不同溶劑對(duì)β-胡蘿卜素的提取得率，結(jié)果見圖2。

圖2 溶劑種類對(duì)β-胡蘿卜素提取得率的影響

從圖2可以看出，乙醇的提取得率較低，這可能與乙醇的極性較大而β-胡蘿卜素極性較弱有關(guān)。但石油醚、丙酮、正己烷和乙酸乙酯4種溶劑對(duì)β-胡蘿卜素的提取得率相差不大，沒有明顯的差異。因此，理論上這4種溶劑均可用于三孢布拉氏霉干菌體中β-胡蘿卜素的提取。但實(shí)際生產(chǎn)中，除考慮提取得率之外，還要考慮溶劑的成本和安全性及溶劑的回收利用等因素。因此，后面的提取條件研究中，選擇了價(jià)格相對(duì)便宜的石油醚作為提取溶劑。

2.3料液比對(duì)β-胡蘿卜素提取得率的影響精確稱取干菌粉0.1 g，分別按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25 g/ml的料液比加入石油醚，在40 ℃下浸提2 h，分別測定在不同料液比下β-胡蘿卜素的提取得率，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)β-胡蘿卜素提取得率的影響

從圖3可以看出，隨著料液比的減小，β-胡蘿卜素提取得率逐漸增加。當(dāng)料液比達(dá)到1∶15 g/ml時(shí)，提取得率達(dá)到最大值。料液比進(jìn)一步減小，提取得率沒有明顯的增加，反而會(huì)使溶劑的用量增加，提取液濃度下降，增加溶劑回收的工作量和成本。因此，提取料液比達(dá)到1∶15 g/ml即可。

2.4提取時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素提取得率的影響精確稱取干菌粉0.1 g，按1∶15 g/ml的料液比加入石油醚，在40 ℃下浸提不同時(shí)間，分別測定在不同浸提時(shí)間下β-胡蘿卜素的提取得率，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素提取得率的影響

從圖4可以看出，隨著浸提時(shí)間的延長，β-胡蘿卜素的提取得率逐漸增加。當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到2 h時(shí)，提取得率達(dá)到最大值。浸提時(shí)間進(jìn)一步延長，提取得率不再增加，反而有所下降，這可能是β-胡蘿卜素在光照下不穩(wěn)定分解所致。因此，提取時(shí)間2 h即可。

2.5提取溫度對(duì)β-胡蘿卜素提取得率的影響精確稱取干菌粉0.1 g，按1∶15 g/ml的料液比加入石油醚，在不同的水浴溫度下浸提2 h，分別測定在不同浸提溫度下β-胡蘿卜素的提取得率，結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)β-胡蘿卜素提取得率的影響

從圖5可以看出，當(dāng)溫度較低時(shí)，隨著溫度的提高，β-胡蘿卜素的提取得率逐漸增加。這可能是因?yàn)闇囟壬?，分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)加快，有利于色素分子向溶劑中的溶解。但當(dāng)溫度超過40 ℃時(shí)，提取得率不再增加，反而有一個(gè)明顯的下降，這可能是溫度過高，加上光照的作用，加速了β-胡蘿卜素的氧化分解。因此，提取溫度達(dá)到40 ℃即可，不宜過高。

3 討論

目前，有大量文獻(xiàn)報(bào)道了從各種不同的天然植物原料中提取類胡蘿卜素的研究，所得出的最佳溶劑種類不盡相同，有丙酮、乙酸乙酯、石油醚或它們的混合溶劑[5-7]，但該試驗(yàn)研究結(jié)果卻表明，丙酮、乙酸乙酯、石油醚和正己烷4種溶劑對(duì)三孢布拉氏霉干菌體中β-胡蘿卜素的提取得率相差不大，沒有明顯的差異，這可能與不同的原料中胡蘿卜素的分布及結(jié)合狀態(tài)不同有關(guān)。陳鵬等報(bào)道了利用超聲法從三孢布拉氏霉中提取β-胡蘿卜素的研究，所得出的最佳溶劑是乙酸乙酯[8]，這可能與菌株來源不同及發(fā)酵條件不同等有關(guān)。

6號(hào)溶劑油(又稱6號(hào)輕汽油)是目前國內(nèi)浸出法生產(chǎn)植物色拉油的主要溶劑，其使用技術(shù)的可靠性和安全性已得到廣泛的認(rèn)可。6號(hào)溶劑油的主要成分是正己烷和環(huán)己烷的混合物，其對(duì)三孢布拉氏霉干菌體中β-胡蘿卜素的提取得率應(yīng)與前面4種溶劑相差無幾。由于該溶劑使用量大，供應(yīng)充足，價(jià)格也相應(yīng)便宜，因此在今后的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中，利用6號(hào)溶劑油從三孢布拉氏霉干菌體中提取β-胡蘿卜素也應(yīng)是一個(gè)很好的選擇。

該試驗(yàn)研究從三孢布拉氏霉干菌體中提取β-胡蘿卜素，其提取得率比從其他天然動(dòng)植物原料中的提取得率普遍要高出很多，盡管所使用的菌種還只是從中國典型培養(yǎng)物保藏中心購買的原始出發(fā)菌株。這也充分說明，微生物發(fā)酵法依然是生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的理想方法，相比天然原料提取法而言，具有產(chǎn)量高、不受環(huán)境因素影響、安全及成本低等優(yōu)勢。湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室今后將對(duì)發(fā)酵菌株進(jìn)行多輪誘變選育，以進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)量，降低成本，從而為今后的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

[1] 王雪.β-胡蘿卜素的研究進(jìn)展[J].中國化工貿(mào)易，2013(5)：193.

[2] 13種食品著色劑國家標(biāo)準(zhǔn)初稿完成[J].中國釀造，2010(11)：159.

[3] 張婷婷，葛佳，牛天貴，等.三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵條件的研究[J].食品科技，2009，11(34)：2-7.

[4] 顏?zhàn)魑?，王常高，蔡?三孢布拉氏霉菌產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵科技，2013，49(2)：25-29.

[5] 甄天元，幕鴻雁.橙皮中類胡蘿卜素的提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(29)：14493-14495.

[6] 趙永彬，尹明安.不同溶劑對(duì)胡蘿卜中類胡蘿卜素提取的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33(4)：671，673.

[7] 王敏，祝淵靜，趙國良，等.天然胡蘿卜素的提取及分離[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，24(3)：28-32.

[8] 陳鵬，王婧，陳聰，等.超聲法提取三孢布拉氏霉中的β-胡蘿卜素[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28(6)：418-420.