張文麗詹宇豪沈俊明蔣守芳王寒李旗鄭德松劉國榮李倩

針刺對慢性腦缺血腦皮質(zhì)區(qū)自由基相關(guān)指標影響及其機制*

張文麗①詹宇豪②沈俊明②蔣守芳③王寒①李旗②鄭德松②劉國榮②李倩①

目的：明確針刺對慢性腦缺血的腦皮質(zhì)區(qū)自由基相關(guān)指標影響及其機制。方法：將實驗大鼠隨機分為正常、慢性腦缺血（IR）和針刺組，對比觀察各組動物慢性腦缺血5周時腦皮質(zhì)病理變化及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）含量的影響。結(jié)果：IR組SOD 值較正常組顯著降低，針刺組的SOD活性表達明顯高于IR組，ROS、XOD活性低于IR組，而MDA的活性明顯低于IR組（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：針刺對慢性腦缺血有一定保護作用，此作用機制可能是針刺通過清除自由基，降低脂質(zhì)過氧化應激而保護慢性腦缺血的神經(jīng)功能損傷。

針刺； 自由基； 慢性腦缺血

慢性腦缺血表現(xiàn)為頭痛、頭暈、失眠、記憶力減退、健忘等癥狀，是臨床常見病、多發(fā)病之一；近年來呈逐年上升并有年輕化的趨勢，嚴重影響人們的生活質(zhì)量。在人類對抗腦血管疾病的歷史進程中，針刺發(fā)揮了非常重要作用，為中華民族的醫(yī)療衛(wèi)生做出了不可磨滅的貢獻，是中國腦血管病防治的特色所在[1-3]?，F(xiàn)代實驗研究發(fā)現(xiàn)針刺能不同程度提高腦耐缺血缺氧能力，而且對慢性腦缺血多偏重于臨床治療觀察[4-5]，本文從基礎研究入手旨在探討針刺對慢性腦缺血腦皮質(zhì)區(qū)自由基相關(guān)指標影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 30只Wistar 健康雄性大鼠體重250～320 g；購于北京維通利華公司。SOD、ROS、MDA、XOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物分組 動物隨機分成正常組、慢性腦缺血組（IR）、針刺組，每組10只；針刺組于第一次腦缺血后2 h內(nèi)立即針刺，以后每日一次針刺大椎、百會穴30 min。各組均常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 模型制備 通過兩血管法即雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎建立腦缺血模型，模型大鼠在1周內(nèi)分2次結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈（分別在第1天和第7天）。術(shù)前禁食12 h、禁水4 h。仰臥位，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，頸部消毒后正中切開，鈍性分離出一側(cè)迷走神經(jīng)與頸總動脈，用4號絲線雙重結(jié)扎一側(cè)頸總動脈，縫合時切口內(nèi)注慶大霉素注射液4萬單位預防感染。該側(cè)結(jié)扎后間隔7 d行第二次手術(shù)，同法結(jié)扎該側(cè)頸總動脈。大鼠術(shù)后放保溫毯上使其肛溫保持在36.5～37.0 ℃至蘇醒。制作模型過程中未有死亡動物。

1.4 針刺方法 針刺參照《實驗針灸學》中大鼠的常用針灸穴位定位方法，自制針刺鼠裝置；選取“百會、大椎”?！鞍贂毖ㄔ陧敼钦?，“大椎”穴在背部正中第7頸椎與第1胸椎間。刺法：以30號1寸毫針（天協(xié)牌，蘇州天協(xié)針灸器械有限公司生產(chǎn)）向前斜刺入“百會”5 mm，直刺入“大椎”5 mm。捻轉(zhuǎn)1 min后，留針30 min，每隔5分鐘捻針一次。每天1次，均在上午10點左右進行，連續(xù)治療5周。針刺組大鼠于末次進針后4 h內(nèi)用10%水合氯醛腹腔麻醉后迅速斷頭取腦。

1.5 腦皮質(zhì)病理變化 取額葉皮質(zhì)多聚甲醛內(nèi)固定，然后進行HE染色觀察病理變化。

1.6 腦皮質(zhì)自由基相關(guān)指標的測定 取解凍后腦皮質(zhì)，用天平稱重，按照1：9 w/v加入生理鹽水，組織在水浴中勻漿，低溫離心機中離心10 min取上清液（2000 r/min），采用黃嘌呤氧化酶法測定腦組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力；硫代巴比妥酸法測定腦丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活力含量測定采用比色法。具體操作按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒內(nèi)操作指南進行。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（±s）表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)病理學改變 正常組額葉皮層細胞結(jié)構(gòu)排列整齊，皮層神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞正常。IR組時額葉皮層細胞固縮、壞死，小血管水腫明顯、有的管腔出現(xiàn)閉塞；神經(jīng)元變性壞死，數(shù)量明顯減少，排列稀疏，錐體細胞層變薄，核變淺，基質(zhì)疏松及空泡形成。針刺組額葉皮層，神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)基本正常，出現(xiàn)少量錐體細胞脫失，部分錐體細胞缺血明顯改善，可見膠質(zhì)細胞和小血管增生。

2.2 各組大鼠腦組織ROS、MDA、XOD、SOD的變化 如表1所示，與正常組比較，慢性腦缺血組SOD值顯著降低（P＜0.05）， 而ROS、XOD、MDA均顯著升高（P＜0.01）。與IR 組比較，針刺組SOD 顯著升高（P＜0.05），ROS、XOD、MDA均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠腦組織ROS、MDA、XOD、SOD值的比較（±s）

表1 各組大鼠腦組織ROS、MDA、XOD、SOD值的比較（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01，與IR 組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與正常組比較

SOD （U/mg·prot）正常組 15.30±4.87 59.75±16.13 3.65±0.24 102.05±0.26 IR組 30.24±2.28## 106.12±17.24##7.74±2.27##75.11±0.32#針刺組 20.15±3.22*# 76.07±16.19**# 4.18±0.56*80.12±0.15*組別 ROS （U/mg·prot）MDA （μmol/g·ww）XOD （U/mg·prot）

3 討論

慢性腦缺血是通過各種原因引起長期的腦灌注不足，腦發(fā)生組織病理改變，國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腦梗死和老年癡呆癥的發(fā)病前期都曾有長期慢性腦缺血的存在[6]。本實驗通過1周內(nèi)分2次手術(shù)進行永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈，制備慢性腦缺血的動物模型，這種方法實質(zhì)上是以慢性低灌注引起腦缺血缺氧，最終導致神經(jīng)細胞的功能下降、學習記憶功能障礙。此模型能較好地模擬人類因動脈管腔狹窄、動脈粥樣硬化等因素導致的血管性腦卒中。有人認為大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后2.5 h腦血流量減少25%～90%，1周后仍下降并持續(xù)數(shù)月。且結(jié)扎1周皮層葡萄糖利用下降20%～30%，海馬葡萄糖利用下降15%。雙側(cè)頸總動脈術(shù)后3周即為慢性缺血期[7]。氧化應激損傷被認為是引起慢性腦缺血后神經(jīng)細胞損傷的重要因素之一。神經(jīng)細胞對氧自由基極為敏感，產(chǎn)生一系列自由基連鎖反應，攻擊灰質(zhì)的神經(jīng)元等富含脂質(zhì)的腦組織，造成嚴重的氧化應激狀態(tài)，誘導細胞調(diào)亡，并使初始缺血損傷不嚴重的神經(jīng)元也發(fā)生壞死[8]。

根據(jù)傳統(tǒng)理論，針刺可以疏通經(jīng)絡，調(diào)和氣血，治療疾病。其治療機理也越來越成為研究的熱點。Tanaka等[9]發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù)后1 d至6周，SOD活性較對照組下降明顯；其他實驗也發(fā)現(xiàn)電針能降低大鼠腦組織內(nèi)MDA含量， 增強SOD活性[10-11]。這與筆者的部分結(jié)果相一致。在慢性腦缺血過程中，自由基直接攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，使其發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，從而導致神經(jīng)元的損傷[8]。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應的代謝產(chǎn)物，其含量的變化間接的反應了腦組織中氧自由基含量的變化。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，是機體清除氧自由基、防止生成羥自由基、阻斷自由基病理性連鎖反應最重要的防御酶，保護細胞免受損傷。XOD屬需氧脫氫酶類，是體內(nèi)核酸代謝中的重要酶。并且在缺氧過程中其對自由基的產(chǎn)生起了重要作用。ROS通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至導致其壞死。本研究結(jié)果顯示，針刺后腦組織中ROS、MDA 和XOD 水平降低，而抗氧化酶SOD活性升高，說明針刺減輕慢性腦缺血的損傷與其抗氧化作用有關(guān)。本實驗研究顯示針刺可以改善慢性腦缺血大鼠額葉皮層神經(jīng)細胞、錐體細胞變性、壞死，血管水腫等不可逆的病理生理損傷，其一系列變化與氧化應激密切相關(guān)。因此針刺可以挽救瀕死的神經(jīng)元、啟動應激機制、防止腦細胞脂質(zhì)過氧化、減輕自由基對機體的損傷。但較多環(huán)節(jié)較多靶點的參與機制還需進一步深入研究。

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Effect of Acupuncture on Indexes Related to Free Radicals in Cortex in Chronic Cerebral Ischemia Rats and Its Mechanism/

ZHANG Wen-li，ZHAN Yu-hao，SHEN Jun-ming，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（15）：031-033

Objective：To explore the effect of acupuncture on indexes related to free radicals in cortex in chronic cerebral ischemia rats and its mechanism.Method：Rats were randomly divided into the control group， the chronic cerebral ischemia （IR） and the acupuncture group. The pathological change and the content of superoxide dismutase （SOD），reactive oxygen species （ROS），malondialdehyde（MDA），xanthine oxidase （XOD） in cortex of rats were detected after five weeks.Result：The expression of SOD in the acupuncture group was significantly higher than that in group IR.The activity of SOD in the acupuncture group was significantly higher than that in IR group，and the content of ROS， MDA and XOD activity was all much lower than that in IR group （P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Acupuncture has protective effect on chronic cerebral ischemia by scavenging free radicals and reducing lipid peroxidation to relieve the neuron damage.

Acupuncture； Free radicals； Chronic cerebral ischemia

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.15.011

2014-03-04） （本文編輯：陳丹云）

唐山市科技局項目（13130294z）；河北省中醫(yī)藥管理局研究項目（2013072）

①河北聯(lián)合大學醫(yī)學實驗研究中心 河北 唐山 063000

②河北聯(lián)合大學中醫(yī)學院

③河北聯(lián)合大學公共衛(wèi)生學院

劉國榮

First-author’s address：Medical Laboratory Research Center， Hebei United University， Tangshan 063000，China