周乃富 ，譚曉風(fēng) ，黃麗媛 ，龍洪旭

（中南林業(yè)科技大學(xué)a.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

油桐Vernicia fordii是我國特有的經(jīng)濟(jì)樹種，它與油茶、核桃、烏桕并稱為我國四大木本油料植物[1-2]。油桐種子含油率達(dá)50%～70%，其中約有94%為不飽和脂肪酸。桐油是良好的干性油，具有干燥快、光澤度高、附著力強(qiáng)、絕緣性能好、耐酸耐堿、防腐防銹等優(yōu)良性能，在工業(yè)上用途廣泛[3-6]。桐油為甘油三酯的混合物，從中可探測到的脂肪酸就有9種，主要的有6種，即棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸和酮油酸，其中以桐油酸的含量為最高，約為80%[7]。

從油桐果中提取的桐油，傳統(tǒng)上主要用作工業(yè)原料。隨著環(huán)境問題的日益突出，能源危機(jī)的不斷加劇，油桐作為生物柴油的生產(chǎn)原料，已被列為具有廣闊開發(fā)前景的能源植物[8]。隨著國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，桐油的需求量不斷增加，但是，國內(nèi)的油桐資源少，桐油市場供不應(yīng)求，而且桐油的用途范圍在不斷擴(kuò)大[4]。因此，提高桐油產(chǎn)量、改善桐油油脂品質(zhì)是油桐育種的主要目標(biāo)。然而，采用常規(guī)育種手段，難以滿足現(xiàn)代育種的要求，而通過分子育種調(diào)控油桐脂肪酸生物合成的途徑，促進(jìn)脂肪酸合成關(guān)鍵基因的超量表達(dá)，可以提高油脂的品質(zhì)，改良脂肪酸組分，也可以調(diào)控某一關(guān)鍵基因的表達(dá)，以滿足合成化工、醫(yī)藥等特殊脂肪酸的需求。為此，本文通過對油桐轉(zhuǎn)錄組基因的比對研究，運(yùn)用分子生物學(xué)相關(guān)理論分析了油桐脂肪酸代謝途徑，探討了脂肪酸代謝過程中關(guān)鍵酶基因的具體作用，以期對油桐的種子發(fā)育和油脂合成分子生物學(xué)的研究提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步拓展和深化油桐油脂合成和調(diào)控的分子機(jī)理研究提供必要的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料采集

實(shí)驗(yàn)選取的油桐品種為葡萄桐，采樣地點(diǎn)位于湘西國家油桐種質(zhì)資源保存庫，分別于6、8、10月采集處于不同發(fā)育階段的油桐種子為實(shí)驗(yàn)材料，提取三個時期采集的油桐種子的總RNA，然后對種子的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行RNA測序。

1.2 油桐種仁總RNA的提取和RNA濃度與質(zhì)量的檢測

以Qiagen公司的RNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取油桐種仁中的總RNA。所提取的總RNA是否能達(dá)到RNA-Seq實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)準(zhǔn)（OD260/280為1.8～2.2，28 S ∶ 18 S ＞ 1.0，其濃度≥ 400 ng/μL，其總量≥20 μg，RIN值≥6.5），還需通過Agilent 2100 Bioanalyzer的檢測。

1.3 油桐種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

由深圳華大基因研究院完成種子的轉(zhuǎn)錄組RNA測序工作，通過序列的組裝、Unigene的功能注釋（分別將unigene注釋到NR、NT、SwissProt、KEGG、COG、GO庫中，并分別對注釋到每個庫及所有注釋上的unigene數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計）、Unigene的GO分類（得到相應(yīng)的GO分類圖和GO注釋文件）、Unigene代謝通路分析、編碼蛋白框的預(yù)測（獲得CDS核酸序列和CDS蛋白序列）、Unigene表達(dá)差異分析，來構(gòu)建完整的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。

1.4 油桐種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析

對采集于油桐果實(shí)發(fā)育期的6、8、10月（以下分別簡稱為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）這三個時期的油桐種子中的總RNA進(jìn)行了測序，共得到了58 439條非冗余的Unigen序列，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期采集的種子中分別得到了61 001、54 679、44 495條Unigene序列，共涉及128個pathway。還對三個時期采集的油桐種子的基因表達(dá)量進(jìn)行了兩兩比較，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，大多數(shù)Unigene的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢，說明基因表達(dá)差異顯著。

圖1 油桐種子在三個不同發(fā)育時期差異表達(dá)的基因數(shù)Fig. 1 Number of differential expression genes in V. fordii seeds at three different development periods

2 結(jié)果與分析

2.1 油桐種子脂肪酸代謝途徑涉及的功能基因

油桐果實(shí)發(fā)育期的6、8、10月分別代表了油桐種子油脂合成初期、油脂轉(zhuǎn)化高峰期、油脂積累后期。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中有37個Unigene序列涉及脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism)途徑，占所有非冗余Unigene序列數(shù)的0.06%，采用NCBI的BLAST軟件對這37個Unigene序列進(jìn)行了比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了10個與脂肪酸代謝途徑相關(guān)的主要酶功能基因（詳見表1），其序列與蓖麻Ricinus communis的相關(guān)基因序列比對的相似性很高，均在79%以上，最高達(dá)到96%。

2.2 不同時期油桐種子脂肪酸代謝關(guān)鍵酶功能基因的表達(dá)及其功能特征

油桐種子脂肪酸代謝關(guān)鍵酶功能基因在種子發(fā)育不同階段的表達(dá)差異顯著，在種子發(fā)育的三個時期的兩兩對比（Ⅱ期與Ⅰ期、Ⅲ期與Ⅰ期、Ⅲ期與Ⅱ期）中連接AMP依賴酶(AMP dependent ligase)基因表達(dá)均為上調(diào)，醌氧化還原酶（quinone oxidoreductase）基因表達(dá)均為下調(diào)。醌氧化還原酶能減少醌類轉(zhuǎn)化可能引起的細(xì)胞器及遺傳物質(zhì)的損傷，能保證機(jī)體的正常生理功能，因而受到廣泛的關(guān)注。已有研究結(jié)果[9-14]表明，該基因及其產(chǎn)物與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

2.2.1 油桐脂肪轉(zhuǎn)化高峰期和油脂合成初期相關(guān)功能基因的表達(dá)差異分析

油桐種子脂肪酸代謝關(guān)鍵基因在Ⅱ期和Ⅰ期表達(dá)差異的分析結(jié)果見表2。由表2 可知，長鏈脂肪酸輔酶A連接酶、?；o酶A氧化酶、?；o酶A合成酶、3-羥酰輔酶A脫氫酶、乙醇脫氫酶、3-酮酰輔酶A硫解酶B、?；o酶A脫氫酶共7個關(guān)鍵酶基因表達(dá)上調(diào)，醛脫氫酶和醌氧化還原基因表達(dá)下調(diào)，其中連接 AMP 依賴酶在Ⅰ期沒有表達(dá)。在Ⅱ期大量表達(dá)的關(guān)鍵酶基因有長鏈脂肪酸輔酶A連接酶和3-酮酰輔酶A硫解酶B。其中的乙醇脫氫酶（ADH）在乙醇代謝過程中起著重要作用——主要能將乙醇轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰谑溜灻撋凸麑?shí)的貯藏方面具有重要意義[15]。

表1 油桐種子轉(zhuǎn)錄組中調(diào)控脂肪酸代謝的酶功能基因Table 1 Enzyme functional genes of regulating fatty acid metabolism in V. fordii seed transcriptome

表2 油桐種子脂肪酸代謝關(guān)鍵基因在Ⅱ期和Ⅰ期表達(dá)差異的分析結(jié)果Table 2 Analysis result of differential expression of the key enzyme genes in V. fordii seed fatty acid metabolism at Ⅰ and Ⅱ periods

2.2.2 油桐脂肪積累后期和油脂合成初期相關(guān)功能基因的表達(dá)差異分析

油桐種子脂肪酸代謝關(guān)鍵基因在Ⅲ期和Ⅰ期表達(dá)差異的分析結(jié)果見表3。由表3 可知，?；o酶A合成酶、3-羥酰輔酶A脫氫酶、醛脫氫酶、乙醇脫氫酶、3-酮酰輔酶A硫解酶B、?；o酶A脫氫酶和醌氧化還原酶共7個關(guān)鍵酶基因表達(dá)下調(diào)，長鏈脂肪酸輔酶A連接酶、?；o酶A氧化酶和連接 AMP 依賴酶基因表達(dá)上調(diào)；在Ⅲ期中，除長鏈脂肪酸輔酶A連接酶的表達(dá)量較大外，其余酶基因的表達(dá)量均較小。長鏈酰基輔酶A合成酶（LACS）在脂肪酸代謝中發(fā)揮著重要作用，能將游離脂肪酸活化成酰基輔酶A硫脂，該硫脂能參與信號化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等代謝途徑，并且是β氧化的底物[16-17]。酰基輔酶A（ACX）是β氧化的限速酶，參與催化脂肪酸β氧化第一步反應(yīng)[18-20]。

2.2.3 油桐脂肪積累后期和油脂轉(zhuǎn)化高峰期相關(guān)功能基因的表達(dá)差異分析

油桐種子脂肪酸代謝關(guān)鍵基因在Ⅲ期和Ⅱ期表達(dá)差異的分析結(jié)果見表4。由表4 可知，只有連接 AMP 依賴酶基因表達(dá)上調(diào)，其余關(guān)鍵酶基因表達(dá)均下調(diào)，在Ⅲ期中，3-酮酰輔酶A硫解酶B基因的表達(dá)量最大。

2.3 油桐種子脂肪酸代謝的調(diào)控過程

脂肪酸代謝，首先是將脂肪酸進(jìn)行活化，在脂酰輔酶A合成酶的催化下生成脂酰輔酶A，活化后生成的脂酰輔酶A其極性增強(qiáng)，易溶于水；分子中有高能鍵，其性質(zhì)活潑，是酶的特異底物，與酶的親和力大，更易參加反應(yīng)。棕櫚酸在長鏈?；o酶A合成酶（long-chain acyl-CoA synthetase）的催化下轉(zhuǎn)化成十六酰輔酶A，由于其極性增強(qiáng)，在酰基輔酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase）和脂肪酰輔酶A脫氫酶（acyl-CoA dehydrogenase）的共同作用下，形成反式-十六酰-2-烯酰輔酶A，在烯酰輔酶A水合酶（enoyl-CoA hydratase）的進(jìn)一步催化下轉(zhuǎn)化為（s）-3-羥基-十六酰-輔酶A，再由兩種脫氫酶——3-羥酰基-輔酶A脫氫酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase）和長鏈羥?；o酶A脫氫酶（long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase）催化，生成3-氧代異戊烯酰輔酶A，最終在乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶 （acetyl-CoA acyltransferase）的作用下轉(zhuǎn)化為輔酶A和十四烷酰輔酶A。由十六酰輔酶A轉(zhuǎn)化成十四烷酰輔酶A，是一個β-氧化的反應(yīng)過程，脂酰CoA在線粒體基質(zhì)中進(jìn)入β氧化要經(jīng)過四步反應(yīng)（即脫氫、加水、再脫氫和硫解），生成一分子輔酶A和一個少兩個碳的新的脂酰輔酶A。脂肪酸代謝就是經(jīng)過多次的β-氧化的反應(yīng)過程來縮短脂肪酸碳鏈，最終生成乙酰輔酶A。通過β-氧化可將長鏈脂肪酸改造成長度適宜的脂肪酸，供代謝所需。

表3 油桐種子脂肪酸代謝關(guān)鍵基因在Ⅲ期和Ⅰ期表達(dá)差異的分析結(jié)果Table 3 Analysis result of differential expression of the key enzyme genes in V. fordii seed fatty acid metabolism at Ⅲ and Ⅰ periods

表4 油桐種子脂肪酸代謝關(guān)鍵基因Ⅲ期和Ⅱ期表達(dá)差異分析Table 4 Analysis result of differential expression of the key enzyme genes in V. fordii seed fatty acid metabolism at Ⅲ and Ⅱ periods

3 討 論

圖2 脂肪酸生物代謝途徑示意圖Fig. 2Diagram of fattyacidmetabolismpathway

桐油是中國的特產(chǎn)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，在中國已有1 300多年的使用歷史。與對油桐種植加工的研究一樣，對桐油的研究也引起了人們的關(guān)注，并取得了一定的成果[21]。傅偉昌等人[22]采用2-氨基-2-甲基丙醇 (2-amino-2-methylpropano,l AMP)衍生化、 GC/M S法分析出桐油的脂肪酸組成，即硬脂酸（3.71%）、軟脂酸（3.41%）、油酸（7.07%）、亞油酸（7.51%）、亞麻酸（1.31%）、十八碳共軛三烯酸（73.19%）及未確定的成分（3.80%）。植物油中含有10%～20%的飽和脂肪酸，其主要成分是棕櫚酸（C16∶0）。棕櫚酰-ACP在脂肪酸代謝過程很關(guān)鍵, 其碳鏈既能在乙酰-ACP硫脂酶作用下脫 ACP 形成棕櫚酸并轉(zhuǎn)化為貯存態(tài)油，也可以被 3-酮酯酰ACP合成酶Ⅱ進(jìn)一步延長，因此植物油中飽和脂肪酸的含量主要是由3-酮酯酰ACP合成酶Ⅱ和硫酯酶活性決定的[23]。

本研究采用RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)對油桐種子發(fā)育不同時期的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較研究，將油桐種子發(fā)育過程中差異表達(dá)的基因進(jìn)行了GO和Pathway信號途徑分類，初步明確了參與脂肪酸代謝的蛋白質(zhì)的功能，為進(jìn)一步研究基因表達(dá)變化和油脂代謝之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。盡管植物脂代謝途徑相當(dāng)復(fù)雜,隨著近年來分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，大多數(shù)反應(yīng)步驟已研究得相當(dāng)透徹[24]，分離了許多關(guān)鍵酶的基因, 使得利用遺傳工程手段調(diào)控脂肪酸代謝途徑、改變脂肪酸成分成為可能[25]。研究油桐種子中油脂積累和轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理有助于對油桐進(jìn)行定向的遺傳改良，同時這對其他油料作物的基礎(chǔ)研究也有一定的參考價值。

到目前為止，油桐的分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)薄弱，能供參考的研究內(nèi)容很少。本研究從整個轉(zhuǎn)錄組的層面分析了油桐種子發(fā)育過程中脂肪酸代謝相關(guān)酶類的表達(dá)模式，為油桐油脂合成機(jī)理的研究提供了參考，但對油桐種子中油脂代謝機(jī)理的闡明還需大量的驗(yàn)證和深入的研究。

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