趙小云，管中華，李齊激，王道平，楊小生，*

（1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550002；2.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550002）

瓜蔞籽中脂肪酸組成型態(tài)及抗氧化活性

趙小云1，2，管中華2，李齊激2，王道平2，楊小生1，2，*

（1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550002；2.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550002）

采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合甲基化處理方法，對(duì)瓜蔞籽油中總脂肪酸、結(jié)合態(tài)脂肪酸（脂肪）和游離脂肪酸進(jìn)行分析測(cè)試，并對(duì)其自由基清除能力進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：瓜蔞籽富含油脂，出油率達(dá)52%，其中以結(jié)合態(tài)脂肪酸為主，占總脂肪酸的99%；不飽和脂肪酸占總脂肪酸的83.3%，主要成分為亞油酸、油酸和亞麻酸；抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)瓜蔞籽油在濃度為1.0mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基清除率達(dá)95.0%，其對(duì)羥基自由基的清除率具有量效關(guān)系。因此，瓜蔞籽油為一種富含結(jié)合態(tài)不飽和脂肪酸的植物油，可作為功能性食用油脂來(lái)開(kāi)發(fā)利用。

瓜蔞籽，結(jié)合態(tài)脂肪酸，抗氧化活性

瓜蔞來(lái)源于葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Marim的果實(shí)，主產(chǎn)地山東、河南、河北[1]，現(xiàn)已在貴州省綏陽(yáng)縣兆福農(nóng)業(yè)科技有限公司引種栽培超過(guò)3000畝，未來(lái)幾年將達(dá)萬(wàn)畝的種植規(guī)模，是重要的經(jīng)濟(jì)藥材之一。其種子、果皮、根均可入藥，具有清熱化痰，寬胸散結(jié)、潤(rùn)燥滑腸、痛瘡腫毒等功效，主治熱病口渴，消渴多飲，肺熱燥咳，瘡瘍腫毒。文獻(xiàn)報(bào)道瓜蔞籽含有的大量的油脂類成分，且其還含有蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素及多種維生素[2]等，其脂肪酸的主要成分為亞油酸，該成分是在人體內(nèi)不能自行合成，必需通過(guò)體外攝取的不飽和脂肪酸[3]，具有抗血栓、降血脂、降膽固醇、促進(jìn)大腦發(fā)育、改善或保護(hù)血管壁，防止動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[4]。但瓜蔞籽油中脂肪酸的結(jié)合型態(tài)、抗氧化活性（自由基清除）的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

近年來(lái)，植物油脂，特別是富含不飽和脂肪酸的植物油脂，在食品、保健食品中的應(yīng)用，受到廣泛關(guān)注。本文對(duì)栽培品種瓜蔞籽總脂肪酸中結(jié)合態(tài)脂肪酸和游離脂肪酸的含量和組分分析以及抗氧化活性進(jìn)行研究，為有效開(kāi)發(fā)利用該資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瓜蔞籽 由貴州省綏陽(yáng)縣兆福農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文副教授鑒定為括樓Trichosanthes kririlowii Marim的種子；二苯代苦味基肼自由基（DPPH·） 百靈威公司；抗壞血酸（VC）、橄欖油 上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司，20041101；石油醚（沸程30～60℃）、甲醇、正己烷、氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂、濃硫酸、無(wú)水乙醇、H2O2、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、氫氧化鉀、碳酸鈉、濃鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HP6890/HP5975C型GC/MS聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；HP-8453型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 惠普公司；FA114型電子天平 上海?？惦娮觾x器廠；EYELA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司；恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司；DZ-2A型真空干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 瓜蔞子油的提取[5]取瓜蔞籽12g，去其種皮，在研缽中快速研磨，然后置于索氏提取器中連續(xù)回流提取，提取條件：溫度45℃，溶劑石油醚，提取時(shí)間3h（兩次），料液比1∶10。真空濃縮，得到的瓜蔞籽油在常溫下干燥至恒重后，稱重計(jì)算出油率。出油率可按下式公式計(jì)算[6]：

式中：Y-出油率；W1-提取瓜蔞籽油重量，g；W2-瓜蔞籽重量，g。

1.2.2 GC-MS分析

1.2.2.1 供試品的制備[7-8]總脂肪酸供試品的制備：取瓜蔞籽油50mg置于容量瓶中，加1mL硫酸-甲醇溶液（2.5mol/L），70℃水浴反應(yīng)30min，冷卻后加2mL正己烷，取上清液即得GC-MS分析用總脂肪酸供試品。

結(jié)合態(tài)脂肪酸供試品的制備：取瓜蔞籽油580mg置于分液漏斗中，加入100mL 5%的Na2CO3水溶液，搖勻，再用100mL正己烷萃取，正己烷層用水洗至中性后加無(wú)水MgSO4干燥濾過(guò)，真空濃縮得結(jié)合態(tài)脂肪酸532mg，從中取50mg置于反應(yīng)瓶中，加入1mL氫氧化鉀-甲醇溶液（2.5mol/L），在50℃水浴中反應(yīng)30min后，加入正己烷萃取后即得GC-MS分析用結(jié)合態(tài)脂肪酸供試品。

游離脂肪酸的制備：取結(jié)合態(tài)脂肪酸供試品的制備項(xiàng)下的Na2CO3水層，先用2mol/L HCl酸化，再用正己烷萃取，正己烷層用水洗至中性后加無(wú)水MgSO4干燥濾過(guò)，真空濃縮得游離脂肪酸5.4mg。按如上總脂肪酸供試品的制備方法進(jìn)行制備，即得GC-MS分析用游離脂肪酸供試品。

據(jù)此也可求得結(jié)合型脂肪酸和游離脂肪酸的比例，可按下式計(jì)算：

結(jié)合型脂肪酸∶游離脂肪酸=W1∶W2

式中：W1-制備所得結(jié)合型脂肪酸的重量，g；W2-制備所得游離脂肪酸的重量，g

1.2.2.2 GC-MS分析條件 氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS 5%Phenyl Sloane（30m×0.25mm×0.25mm）彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫45℃（保留時(shí)間2min）。以3.5℃/min速度升溫至220℃，保持2min。汽化室溫度250℃，載氣為高純He（99.999%），柱前壓7.62psi，載氣流量1.0mL/min，分流比20∶1。

質(zhì)譜檢測(cè)條件 離子源為EI源；離子源溫度280℃；四級(jí)桿溫度150℃；電子能量70eV；發(fā)射電流34.6UA；倍增器電壓1037V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍30～50amu。

通過(guò)HPMSD化學(xué)工作站，結(jié)合WILEY275和NIST2005質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)圖庫(kù)，通過(guò)峰面積歸一化法按下式進(jìn)行計(jì)算，求得各化學(xué)成分的相對(duì)含量，即某組分的色譜峰面積在總色譜峰面積中所占的比例。

1.2.3 抗氧化活性測(cè)定方法

1.2.3.1 羥基自由基清除率的測(cè)定 測(cè)定方法采用Fenton反應(yīng)[9-10]。參照史亞男等[11]學(xué)者的方法，并略作改進(jìn)。取1mL 0.75mmol/L的鄰二氮菲溶液（無(wú)水乙醇配制），加2mL 0.2mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.4），充分混勻后加入1mL 0.75mmol/L的硫酸亞鐵溶液（去離子水配制），每加一管立即混勻，加入1mL濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的樣品溶液，最后加入1mL 0.01%H2O2，于37℃保溫1h，536nm處測(cè)定吸光度為A處理。將體系中的樣品改為加入1mL蒸餾水，測(cè)定得A對(duì)照?？瞻讓?duì)照不加0.01%H2O2，以蒸餾水補(bǔ)充體積，測(cè)定得A空白對(duì)照。每個(gè)質(zhì)量濃度樣品做3個(gè)平行樣品，取平均值。羥基自由基的清除率計(jì)算公式如下：

清除率（%）=（A536處理-A536對(duì)照）/（A536空白對(duì)照-A536對(duì)照）×100

1.2.3.2 DPPH清除率的測(cè)定[12-13]稱取一定量的瓜蔞籽油，分別用無(wú)水乙醇配成濃度為5、10、20、40、60、80、100mg/mL，取2mL樣品溶液，加入2mL 0.2mmol/mL的DPPH溶液，搖勻，于25℃水浴中加熱15min后，以無(wú)水乙醇調(diào)零，測(cè)定517nm處的吸光值A(chǔ)i；取2mL無(wú)水乙醇代替樣品溶液測(cè)得空白吸光度A0；以2mL樣品溶液中加入2mL無(wú)水乙醇，測(cè)得樣品本體吸光度Aj。同一測(cè)定重復(fù)3次，取平均值。按下式計(jì)算清除率：

清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）/A0]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 瓜蔞籽出油率及類型

通過(guò)連續(xù)回流提取法所得瓜蔞籽油呈亮淺黃色，澄清無(wú)沉淀，出油率為52%；結(jié)合態(tài)脂肪酸與游離脂肪酸之比為98.5∶1。不飽和脂肪酸占總脂肪酸的83.3%。由此，瓜蔞籽中富含油脂，且以結(jié)合態(tài)脂肪酸為主，占總脂肪酸的99%。

2.2 瓜蔞籽油脂肪酸組成GC-MS分析

取1.2.2.1項(xiàng)下制備的供試品1000倍稀釋液1μL，在1.2.2.2氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析條件下進(jìn)行分析鑒定。進(jìn)樣后，延遲20min采集圖譜，得到的瓜蔞籽脂肪酸甲酯化成分總離子色譜圖，見(jiàn)圖1～圖3。（注：圖1～圖3上各色譜峰的編號(hào)分別對(duì)應(yīng)表1中的序號(hào)）

由表1可知，瓜蔞籽總脂肪酸的甲酯化物中共檢測(cè)鑒定出11個(gè)化合物，占其色譜峰總面積的99.6%，不飽和脂肪酸占82.5%，主要成分為亞油酸甲酯（31.302%）、（Z）-9-十八碳烯酸甲酯（油酸甲酯）（41.372%）、亞麻酸甲酯（7.362%）、棕櫚酸甲酯（11.430%）和硬脂酸甲酯（5.724%）；結(jié)合態(tài)脂肪酸的甲酯化物中共檢測(cè)鑒定出15個(gè)化合物，占其色譜峰總面積的95.9%，不飽和脂肪酸占84.9%，主要成分為亞油酸甲酯（31.534%）、（Z）-9-十八碳烯酸甲酯（24.397%）、亞麻酸甲酯（28.877%）、棕櫚酸甲酯（8.945%）；游離脂肪酸的甲酯化物中共檢測(cè)鑒定出7個(gè)化合物，占其色譜峰總面積的85.3%，不飽和脂肪酸占31.4%，主要成分為棕櫚酸甲酯（27.885%）、亞油酸甲酯（11.583%）、（Z）-9-十八碳烯酸甲酯（19.818%）、硬脂酸甲酯（17.977%）、芥酸甲酯（20.171%）。其中以結(jié)合態(tài)脂肪酸為主，占總脂肪酸的99%；不飽和脂肪酸占總脂肪酸的83.3%

圖1 總脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the methylated total fatty acids

表1 瓜蔞籽脂肪酸甲酯化成分及含量Table 1 Components and contents of the methylated fatty acids in the seed oil of T.ririlowii

圖3 游離態(tài)脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of the methylated free fatty acids

由此可知，瓜蔞籽油肪中，以不飽和脂肪酸亞油酸、油酸（9-十八碳烯酸）和亞麻酸為主，為富含結(jié)合態(tài)不飽和脂肪酸的植物油。與沈俊劍等[14]報(bào)道的瓜蔞籽脂肪酸成分的組成與含量有一定差異，可能是由于引種栽培、自然生境、提取方法等等因素導(dǎo)致的。

2.3 瓜蔞籽油抗氧化活性

自由基具有很強(qiáng)的化學(xué)性質(zhì)，正常生物體內(nèi)自由基處于穩(wěn)衡動(dòng)態(tài)[15]，一旦平衡被打破會(huì)產(chǎn)生多種自由基，自由基與衰老、癌癥、心腦血管疾病及炎癥的發(fā)生有密切的關(guān)系[16]。因此，瓜蔞籽油的自由基清除能力，將從一定角度反映其開(kāi)發(fā)產(chǎn)品的保健功能。

2.3.1 DPPH自由基清除結(jié)果 DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，通過(guò)測(cè)定其吸收減弱的程度，可評(píng)價(jià)自由基清除劑的活性[17]。從圖4可知，瓜蔞籽油具有一定的清除DPPH自由基的能力，隨著瓜蔞籽油濃度的增加，自由基清除率呈上升趨勢(shì)，具有量效關(guān)系，當(dāng)瓜蔞籽油濃度為100mg/mL時(shí)，清除率達(dá)80.2%，但其清除DPPH自由基的能力弱于對(duì)照樣品（VC和橄欖油）。

圖4 瓜蔞籽油DPPH自由基清除率Fig.4 Scavenging effects of seed oil of T.kirilowii on DPPH free radical

2.3.2 羥基自由基清除結(jié)果 羥基自由基在活性氧自由基中反應(yīng)活性最強(qiáng)、毒性最大[18]。對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定是評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物抗氧化活性的重要組成部分。從圖5可知，隨著瓜蔞籽油濃度的增加，清除羥基自由基的能力呈明顯的上升趨勢(shì)，當(dāng)瓜蔞籽油濃度為1.0mg/mL時(shí)，清除率達(dá)95.0%。清除率達(dá)50%時(shí)，瓜蔞籽油、橄欖油、VC的質(zhì)量濃度（ED50）分別0.12、0.14、0.09mg/mL，表明，瓜蔞籽油清除羥基自由基的能力強(qiáng)于橄欖油，稍弱于VC，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖5 瓜蔞籽油羥基自由基的清除率Fig.5 Scavenging effects of seed oil of T.kirilowii on ·OH radical

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)瓜蔞籽油提取率、脂肪酸存在的型態(tài)和抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)瓜蔞籽富含油脂，脂肪酸以結(jié)合態(tài)為主，以亞油酸、油酸和亞麻酸為主要成分。同時(shí)，兩種抗氧化活性測(cè)試結(jié)果均顯示該種子油具有抗氧化活性。綜上所述，瓜蔞籽是一種富含結(jié)合態(tài)不飽和脂肪酸的經(jīng)濟(jì)作物，且具有較好的自由基清除能力，應(yīng)該在功能性食用油脂領(lǐng)域具有較好開(kāi)發(fā)前景。

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Fatty acid composition and antioxidant activity of seed oil from Trichosanthes kirilowii

ZHAO Xiao-yun1，2，GUAN Zhong-hua2，LI Qi-ji2，WANG Dao-ping2，YANG Xiao-shengl，2，*
（1.College of Pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550002，China；2.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China）

The total fatty acids，bound and free fatty acids of seed oil from Trichosanthes kirilowii were identified by GC-MS technique together with method of methylation reaction，and the scavenging capacity of free radical were analyzed.The results showed that the seed of T.kirilowii was rich in fatty oil and its oil yield ration could reach 52%，the bound fatty acids（99%）were dominant component in the total fatty acids.Unsaturated fatty acids accounted for 83.3%，the main constituents were Linoleic acid，Oleic acid（9-Octadecenoic acid）and（Z，Z，Z）-9，12，15-Octadecenoic acid.The results of antioxidant activities showed that the seed oil had doeseffect relationship in scavenging activities of hydroxyl radical in vitro and the hydroxyl radical scavenging rate of 95.0%was observed at the concentration of 1.0mg/mL.In conclusion，the seed oil of T.kirilowii which was rich in unsaturated bound fatty acids should be a kind of functional edible oils for developing health foods.

Trichosanthes kirilowii；bound fatty acids；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-0306（2014）10-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.031

2013－12－19 *通訊聯(lián)系人

趙小云（1989-），女，碩士研究生，研究方向：藥物化學(xué)。

貴州省科技廳項(xiàng)目（黔科合人才團(tuán)字（2013）4006）；黔科合重大專項(xiàng)（字[2013]6006號(hào)）。