祭仲石，管衛(wèi)兵、2，蘇孫國，張明月

(1.上海海洋大學 海洋科學學院，上海201306;2.上海海洋大學 大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點實驗室，上海201306)

腸道微生物是魚類腸道的重要組成部分，其具有營養(yǎng)、防御和免疫調(diào)節(jié)等生理功能，并且對魚類的生長發(fā)育具有重要影響［1-3］。魚類腸道微生物與所處的腸道環(huán)境及魚類生活的水體環(huán)境緊密相關(guān)，所以更容易受到食物供給、環(huán)境變化等的影響，且魚類的生長發(fā)育也會對腸道微生物產(chǎn)生影響［4-5］。目前，已有學者研究了鰱Hypophthalmichthys molitrix、鳙Aristichthys nobilis 腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能［6-7］。由于大部分腸道微生物處于不可培養(yǎng)狀態(tài)，使得通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法研究環(huán)境微生物的群落結(jié)構(gòu)比較困難。變性梯度凝膠電泳(DGGE)具有突變檢出率高、檢測片段小、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于分析自然環(huán)境、腸道微生物的生物多樣性和群落動態(tài)等的研究中［8-11］。本研究中，使用聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)方法，研究了南太湖湖州水域鰱、鳙的腸道微生物，建立了腸道微生物的DGGE 指紋圖譜，分析其群落結(jié)構(gòu)和多樣性，以期為魚類腸道微生物的鑒定、定植益生菌的開發(fā)和養(yǎng)殖環(huán)境的改善等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2011年11月在南太湖湖州水域采集野生鰱、鳙，每尾魚的體質(zhì)量均為4 kg 左右。

1.2 方法

在無菌環(huán)境下，取魚腸道內(nèi)含物，置于無菌離心管中，每種魚設(shè)3 個重復(fù)，并將樣品于冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 腸道微生物總基因組DNA 的提取在無菌狀態(tài)下，將鰱、鳙腸道內(nèi)含物研磨成糊狀，分別用糞便基因組DNA 提取試劑盒(天根生化公司)提取魚類腸道內(nèi)含物的微生物總基因組，然后置于冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 16S rDNA 的PCR 擴增 采用原核微生物16S rDNA 通用引物［12］357-F、518-R 擴增樣品腸道微生物基因組DNA 的V3 區(qū)，再將PCR 產(chǎn)物用引物518-R、357-F-GC-clamp 進行擴增，引物序列如表1所示。PCR 反應(yīng)體系(20 μL):10 μL 2×Taq PCR MasterMix(天根生化公司)，2 μL 引物(357-F 1 μL、518-R 1 μL)，1 μL DNA，7 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序:95 ℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進行32 個循環(huán);最后在72 ℃下延伸10 min，于4 ℃下保溫30 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過GoldView 染色后用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 PCR-DGGE 指紋圖譜 將擴增到的16 S rDNA 基因V3 區(qū)進行DGGE 分離，其中變性劑梯度范圍為30% ～60%，電壓設(shè)置為100 V，電泳12 h，用銀染法染色，使用Imager EP(美國ALPHA)凝膠成像系統(tǒng)獲取PCR-DGGE 指紋圖譜。

表1 引物序列Tab.1 The sequence of the primers

使用Quantity One(BIO -RAD Laboratories，CA，USA)軟件對PCR-DGGE 指紋圖譜進行分析，得到DGGE圖譜的相似系數(shù)，對DGGE圖譜進行非加權(quán)配對算術(shù)平均法聚類分析(UPGMA)。

1.2.4 酶連接轉(zhuǎn)化 將PCR 產(chǎn)物用DNA 片段凝膠回收試劑盒(北京三博遠志生物技術(shù)有限公司)進行回收，并連接到PGM-T 載體(天根生化公司)中，然后轉(zhuǎn)入至大腸桿菌感受態(tài)E.coli DH5α中，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌感受態(tài)均勻涂布于LB(含氨芐青霉素100 μg/mL、IPTG、X-Gal)的固體培養(yǎng)基上，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)12 h。

1.2.5 測序 選擇鑒定后的陽性克隆送交上海杰李生物技術(shù)有限公司進行測序。將測到的微生物序列 在GeneBank 里 進 行 比 對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，尋找并下載基因庫中與測序結(jié)果最為相似的16S rDNA 基因序列。

2 結(jié)果

2.1 鰱、鳙腸道菌群的PCR－DGGE 指紋圖譜

圖1 為太湖鰱、鳙腸道微生物的DGGE 指紋圖譜，L1 ～L3和Y1 ～Y3 泳道分別代表鰱和鳙的3個樣品，不同位置的條帶代表不同的微生物，條帶的明暗程度代表微生物的相對數(shù)量。圖2 為DGGE指紋圖譜分析示意圖，其中鰱L1 ～L3 樣品的條帶數(shù)分別為18、18、12，平均條帶數(shù)為16，鳙Y1 ～Y3 樣品的條帶數(shù)分別為17、12、13，平均條帶數(shù)為14。DGGE圖譜分析表明，鰱腸道微生物種類多于鳙，但鳙個體之間的差異較鰱大，鰱、鳙腸道微生物存在明顯差異，且各有不同的優(yōu)勢菌條帶。

2.2 指紋圖譜的聚類分析和相似系數(shù)分析

從表2可見:鰱L1 ～L3 樣品的相似系數(shù)分別為0.745、0.576、0.386，平均為0.569;鳙Y1 ～Y3 樣品的相似系數(shù)分別為0.504、0.500、0.866，平均為0.623。相似系數(shù)分析表明，該批樣品中鳙個體間腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性高于鰱，說明采集的鰱、鳙樣品之間腸道微生物有較大的差異。

基于鰱、鳙腸道菌群PCR-DGGE 指紋圖譜進行的UPGMA 聚類分析，結(jié)果如圖3所示。其中，鰱L1、L2、L3 與鳙Y1 聚為一個大枝，鳙Y2、Y3聚為另一個大枝。

圖1 鰱、鳙腸道微生物16S rDNA 變性梯度凝膠電泳(DGGE)指紋圖譜Fig.1 Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)fingerprinting of 16S rDNA intestinal microbials from silver carp Hypophthalmichthys molitrix and bighead carp Aristichthys nobilis

圖2 鰱、鳙腸道微生物16S rDNA 變性梯度凝膠電泳(DGGE)指紋圖譜分析示意圖Fig.2 DGGE fingerprinting sketching map of 16S rDNA intestinal microbials from silver carp H.molitrix and bighead carp A.nobilis

表2 鰱、鳙腸道微生物DGGE圖譜的相似系數(shù)Tab.2 Similarity of DGGE fingerprinting for intestinal microbials in silver carp H.molitrix and bighead carp A.nobilis

2.3 鰱、鳙腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)

對鰱、鳙腸道微生物進行測序，共檢測了33個樣品，成功測序樣品27 個，失敗樣品6 個，其中鰱共檢測到14 個微生物序列，鳙共檢測到13 個微生物序列，測序結(jié)果如表3所示。鰱腸道微生物中檢測到假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、梭桿菌屬、突柄桿菌屬、乳球菌屬和紅細菌屬等，鳙腸道微生物中檢測到假單胞菌屬、金黃桿菌屬、氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和藍藻屬的一些細菌等。分析表明，鰱腸道微生物主要有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門、疣微菌門，分別占測序結(jié) 果 的 14.3%、28.6%、35.8%、14.3%和7.0%;鳙腸道微生物主要有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、藍細菌門，分別占測序結(jié)果的15.4%、23.1%、53.8%和7.7%。

圖3 鰱、鳙腸道微生物DGGE圖譜的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of DGGE fingerprinting for intestinal microbials in silver carp H.molitrix and bighead carp A.nobilis

表3 鰱、鳙腸道微生物16S rDNA 特征片段序列分析結(jié)果Tab.3 Sequencing analysis of 16S rDNA intestinal microbials from silver carp H.molitrix and bighead carp A.nobilis

3 討論

腸道為多種細菌提供了良好的生存環(huán)境，腸道細菌在宿主體內(nèi)生存和增殖，對維持宿主的正常生命活動起著十分重要的作用?；隰~類腸道內(nèi)含物基因組的PCR-DGGE圖譜及測定的序列能夠反映魚類腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)。劉淮德等［13］和顏慶云等［14］研究表明，PCR-DGGE 技術(shù)是研究水產(chǎn)動物腸道微生物的有效方法，李可俊等［15］使用PCR-DGGE 方法研究了長江口8種野生魚類的腸道菌群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚類腸道菌群多樣性的差異與魚類的食性相關(guān)，且食性差異大的魚類之間腸道菌群差異也更為明顯。本研究中，使用PCR-DGGE 技術(shù)建立了太湖鰱、鳙腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的DGGE圖譜，鰱腸道微生物多樣性略高于鳙，鰱、鳙腸道微生物存在明顯差異，且各有不同的優(yōu)勢菌條帶;基于PCR-DGGE 指紋圖譜的聚類分析和相似系數(shù)分析表明，鳙腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相似性高于鰱。

周玉法等［6］分析了常見的4 中淡水魚腸道菌群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氣單胞菌屬在鰱腸道微生物菌群中占優(yōu)勢地位，且未檢測出葡萄球菌屬。李學梅等［16］對3種室內(nèi)養(yǎng)殖魚類的腸道微生物進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，斑點叉尾鲴腸道中的菌群主要為變形桿菌，而銀鯽和異育銀鯽腸道中的菌群主要為梭桿菌屬和氣單胞菌屬等。本研究中，在鰱腸道微生物中檢測到假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、梭桿菌屬、突柄桿菌屬、乳球菌屬、紅細菌屬等，在鳙腸道微生物中檢測到假單胞菌屬、金黃桿菌屬、氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和藍藻屬的一些細菌等。在鰱、鳙腸道中都檢測到芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的微生物，此結(jié)果與Zhou等［17］和趙慶新［18］在鯉科魚腸道菌群中未檢測到芽孢桿菌屬的研究結(jié)果并不一致。芽孢桿菌是較常用的水體改良劑和飼料添加劑，不僅可以有效地抑制病原菌等有害微生物的生長，而且可以分解有機物質(zhì)、有機硫化物等，改善水體環(huán)境;芽孢桿菌還能產(chǎn)生多種消化酶，提高魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等。而假單胞菌是常見的條件致病菌，在鰱、鳙腸道中均有檢出，雖然檢出率不高，但也可以反映出，此時期南太湖水域的水質(zhì)不理想。而與其他報道出現(xiàn)的差異有可能是采樣區(qū)域不同或是試驗方法不同所致。

Feng等［19］、Kim等［20］研究表明，變形菌門的微生物是魚類腸道微生物的優(yōu)勢菌群。本試驗結(jié)果表明:鰱腸道微生物群落組成有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、疣微菌門，優(yōu)勢種群為變形菌門和厚壁菌門，占測序總數(shù)的35.8%和28.6%;鳙腸道微生物群落組成有擬桿菌門、變形菌門、藍細菌門、厚壁菌門，其中變形菌門和厚壁菌門的微生物占有明顯的優(yōu)勢，占測序總數(shù)的53.8%和23.1%。該結(jié)果與Feng等［19］、Kim等［20］的研究結(jié)果一致。本試驗中，在鰱腸道內(nèi)還檢測到疣微菌門，這在其他魚類腸道微生物的研究報道中很少提及，因為疣微菌門是被新分類出不久的一類細菌，目前只識別了少數(shù)幾個種類，主要發(fā)現(xiàn)于水體、土壤環(huán)境和人類糞便中，其作用目前尚不清楚。在鳙腸道中還檢測到了藍藻，控制藍藻是治理太湖水域環(huán)境的一個重要工作，藍藻的爆發(fā)會嚴重影響太湖的水質(zhì)安全與環(huán)境，在該批樣品中只檢測到一個藍藻序列，表明此時期南太湖湖州水域中藍藻相對較少，說明對太湖的治理工作有了一定的效果。

魚類腸道微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)與其生境、發(fā)育、攝食餌料等密切相關(guān)。Yoshimizu等［21］研究表明，魚類腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)具有季節(jié)性差異，即微生物數(shù)量在夏季最多，而在冬季最少;尹軍霞等［22］研究表明，南美白對蝦腸道厭氧菌總數(shù)、雙歧桿菌隨水溫的升高而顯著增加;Ward等［23］研究表明，雜食性魚類腸道微生物的多樣性比肉食性魚類高;尹軍霞等［24］研究表明，肉食性魚類腸道中厭氧菌和雙歧桿菌比草食性多;周文豪等［25］研究表明，攝食不同餌料會對草魚腸道菌群產(chǎn)生影響。本研究中的樣品全部為同一時期采自南太湖湖州水域，并且均取3 個個體進行同種魚個體之間的比較，降低了環(huán)境等因素對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，雖然鰱、鳙個體之間腸道菌群的PCR-DGGE圖譜并不完全一致，但聚類分析發(fā)現(xiàn)，同種魚的不同個體之間的相似性較高。

對魚類腸道微生物群落結(jié)構(gòu)進行研究，可為開發(fā)飼料添加劑提供科學依據(jù)。張梁等［26］用添加光合細菌的飼料喂養(yǎng)草魚，能夠顯著加快草魚的生長發(fā)育，降低餌料系數(shù)，在一定范圍內(nèi)，超氧化物歧化酶的活性可隨添加水平的增加而上升。由于國內(nèi)養(yǎng)殖廢水很少進行處理，直接排放到自然環(huán)境中，對環(huán)境造成了很大影響，研究魚類腸道微生物，可以指導合理使用微生物制劑，減少對環(huán)境的污染，從而改善魚類的生長性能和開發(fā)定植益生菌等。

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