侯夢(mèng)夢(mèng)，邢冬梅，劉 璇，華聲瑜

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立的關(guān)鍵性問題*

侯夢(mèng)夢(mèng)，邢冬梅，劉 璇，華聲瑜

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

心肌缺血再灌注損傷模型是研究心肌缺血預(yù)適應(yīng)機(jī)制、評(píng)價(jià)抗心肌缺血及心律失常藥物療效的經(jīng)典動(dòng)物模型，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作仍有較多缺陷，需要對(duì)造模的關(guān)鍵技術(shù)不斷完善。加強(qiáng)該模型術(shù)前處理、術(shù)中操作和術(shù)后護(hù)理3個(gè)方面的研究，分析心肌缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)大鼠模型成功建立的關(guān)鍵性問題，并提出解決辦法，組建心肌缺血再灌注損傷模型的規(guī)范化造模流程。

心肌缺血再灌注損傷模型；關(guān)鍵性問題；術(shù)前處理；術(shù)中操作；術(shù)后護(hù)理

目前，冠狀動(dòng)脈再通是急性心肌梗死公認(rèn)的有效治療方法，然而，冠狀動(dòng)脈再通又存在再灌注損傷問題，因而對(duì)再灌注損傷的研究及防治已成為研究的熱點(diǎn)問題。Jennings等[1]于1960年針對(duì)組織細(xì)胞低灌流缺血后獲得血液再供應(yīng)時(shí)，組織細(xì)胞缺血性損害未得以減輕或恢復(fù)，缺血性損傷反而加重的病理變化首次提出了心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的概念。目前心肌梗死的臨床治療手段已由傳統(tǒng)的藥物治療逐漸上升到基因治療、細(xì)胞治療等方法，但任何方法在臨床應(yīng)用前都要經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。近些年，MIRI模型已經(jīng)成為抗MIRI臨床前研究的重要手段，是指導(dǎo)臨床應(yīng)用、復(fù)雜新藥開發(fā)的重要研究方法。但是在MIRI造模過程的實(shí)踐中，存在較多難以把握的關(guān)鍵技術(shù)，能否成功建立MIRI模型已成為值得關(guān)注的問題。

1 術(shù)前處理

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的確定 MIRI模型旨在通過結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，造成急性心肌缺血，并在預(yù)定時(shí)間內(nèi)予以再灌注，已成為模擬人類缺血性心臟病恢復(fù)血供必需的實(shí)驗(yàn)方法[2]?，F(xiàn)代研究中，用于建立MIRI模型的常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有：豬、犬、兔、羊、小鼠及大鼠等[3]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇依照接近人體病理生理的原則，選擇進(jìn)化關(guān)系上接近人類的大鼠，其基因背景清楚、繁殖周期短、冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)少、心肌壞死出現(xiàn)早、模型重復(fù)率高，結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支造成心肌梗死是目前國內(nèi)外公認(rèn)的模型制備方法[4]。在實(shí)驗(yàn)過程中，建立MIRI模型應(yīng)選擇為鼠齡9～11周，體質(zhì)量為220～280 g的大鼠。

1.2 麻醉處理 隨著麻醉技術(shù)的飛速發(fā)展，采用現(xiàn)代麻醉藥物傳遞系統(tǒng)理念，結(jié)合傳統(tǒng)麻醉藥物的施藥特點(diǎn)、動(dòng)物的反應(yīng)，摒除毒性作用較大的烏拉坦和麻醉誘導(dǎo)時(shí)間較長的水合氯醛，采用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，其麻醉誘導(dǎo)時(shí)間短，對(duì)心臟毒性小，且大鼠術(shù)后蘇醒快，劑量易掌握[5]。在麻醉過程中，應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：1）麻醉藥現(xiàn)用現(xiàn)配，防止日久變質(zhì)。2）實(shí)驗(yàn)大鼠均嚴(yán)格稱質(zhì)量，精確計(jì)算麻醉藥量，3%的戊巴比妥鈉腹腔注射劑量1.5 mL/kg[6]。3）麻醉藥盡量一次性注射到實(shí)驗(yàn)大鼠的腹腔內(nèi)，避免中途補(bǔ)藥造成死亡，若因種種原因未將麻醉藥注射完全，應(yīng)改用其他待做大鼠麻醉[7]。4）在麻醉劑給予過程中，基礎(chǔ)給藥量確定后，應(yīng)根據(jù)動(dòng)物對(duì)麻醉藥的反應(yīng)，適時(shí)對(duì)給藥量進(jìn)行微調(diào)[6]。5）實(shí)驗(yàn)中加用1%的普魯卡因進(jìn)行局部麻醉，可有效減輕大鼠的疼痛反應(yīng)，降低麻醉藥的使用量，降低呼吸抑制作用。6）麻醉期間，使用37℃的電熱毯進(jìn)行保溫。

2 術(shù)中操作

2.1 開胸方式 曾有研究在實(shí)驗(yàn)過程中將肋骨剪斷，擴(kuò)大手術(shù)視野，對(duì)大鼠造成較大損傷，極易引起心律失常致死[8]。在實(shí)驗(yàn)過程中，在麻醉后背位固定大鼠，首先用手觸摸其心尖搏動(dòng)處，確定心臟在胸腔中的大體位置。沿胸骨左緣心臟搏動(dòng)處縱向剪開皮膚2～3 cm，用止血鉗逐層分離皮下肌肉，暴露左第3、4肋[9]。再用16 cm彎頭止血鉗迅速沿胸骨左緣3、4肋間隙插入胸腔分開肋骨，將心臟輕柔迅速的擠出胸腔，掛線結(jié)扎，結(jié)果顯示成功率較高，改良方法重視細(xì)節(jié)上對(duì)模型制備的操作，明確指出手術(shù)時(shí)視野、心臟固定的難易程度、大鼠胸腔的正常結(jié)構(gòu)等方面的關(guān)鍵性問題，綜合控制大鼠在開胸過程中的情況，保證模型制作的成功率。在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意以下幾個(gè)狀況：1）在大鼠開胸前，應(yīng)仔細(xì)剪除大鼠胸部毛發(fā)，清理后可使用生理鹽水或碘伏將皮膚擦干凈，避免開胸后毛發(fā)貼在心臟表面與神經(jīng)、血管混淆，影響結(jié)扎操作[10]。2）若出現(xiàn)胸腔粘連，用手術(shù)剪輕輕將心包膜撕裂后再將心臟擠出胸腔，然后按照上面步驟進(jìn)行操作。3）若出現(xiàn)體質(zhì)量過重或者過輕以及罕見的右位心現(xiàn)象，在術(shù)前超聲過程中進(jìn)行標(biāo)記[11]，便于找到正確的位置進(jìn)行開胸。4）實(shí)驗(yàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)注重機(jī)體病理狀態(tài)，摒棄外援呼吸系統(tǒng)，每隔2～5 min用棉簽清理口腔至呼吸道中的分泌物，防止大鼠窒息死亡。

2.2 結(jié)扎過程的關(guān)鍵性問題

2.2.1 結(jié)扎操作 結(jié)扎前于心臟大靜脈處放1根實(shí)心玻璃絲引線（1.5～2.0 mm），石蠟油潤滑后[7]，用6/0無創(chuàng)縫合針于左心耳根部下方2 mm處穿過心肌表層，在肺動(dòng)脈圓錐旁出針[12]，進(jìn)針深度為0.5～1.0 mm、寬度為2.0～3.0 mm[13]，此時(shí)稍微輕輕用力拉起縫合線兩端，心尖的左室前壁失去原有光澤而顯暗灰色或青紫色，左室收縮活動(dòng)減弱及此過程動(dòng)態(tài)心電圖中出現(xiàn)ST段弓背向上持續(xù)抬高和R波增高的現(xiàn)象，初步判斷縫合線牽拉住左冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎位置準(zhǔn)確[14]。若出現(xiàn)因局部刺激導(dǎo)致心肌蒼白，之后很快恢復(fù)正常的現(xiàn)象，或者未見到ST段弓背向上持續(xù)抬高和R波增高的情況，則表明結(jié)扎未成功，立即輕輕抽出縫合線，重新按照以上步驟進(jìn)行再次結(jié)扎操作[15]。在結(jié)扎過程中注意以下幾點(diǎn)：1）進(jìn)針位置：盡量一次成功，由于重復(fù)縫扎會(huì)束縛較多的心肌組織，造成機(jī)械性損傷，易致大鼠胸腔粘連，嚴(yán)重影響模型的穩(wěn)定性。2）進(jìn)針深淺：進(jìn)針深易穿透心室壁，造成大量出血，死亡率較高，進(jìn)針淺易穿過心肌表層，未能準(zhǔn)確結(jié)扎到血管，均會(huì)導(dǎo)致模型建立失敗[16]。3）結(jié)扎松緊度：結(jié)扎過緊易引發(fā)血管斷裂，過松易造成不完全性缺血，均會(huì)影響造模的成功率。為避免這樣的問題出現(xiàn)，模型建立時(shí)為保證手術(shù)的穩(wěn)定均一性，應(yīng)由同一人完成整個(gè)手術(shù)操作。4）心臟出血：用干紗布適當(dāng)力度壓迫出血點(diǎn)，止血效果顯著，切記盲目使用鉗夾以防造成更大的損傷，降低模型成功率。5）摒棄再灌注時(shí)將活結(jié)打開的傳統(tǒng)方法，現(xiàn)采用實(shí)心玻璃絲引線[7]，再灌注時(shí)直接將其抽出的手段，防止縫合線牽扯心肌組織，避免出現(xiàn)不可逆損傷狀況。

2.2.2 結(jié)扎后處理 結(jié)扎后0～30 min大鼠發(fā)生房顫、室速等心律失常的幾率較大，此時(shí)在傷口縫合處滴入少量治療快速室性心律失常的藥物利多卡因（生理鹽水稀釋100倍），使其滲入到心臟組織中，并適當(dāng)給與心外膜按摩，有效緩解心律失常的發(fā)生，減少因心律失常所引起的死亡[17-18]。

2.3 缺血及再灌注時(shí)間選擇

2.3.1 缺血時(shí)間 模型建立過程中，缺血心肌組織在恢復(fù)血液灌注后發(fā)生的細(xì)胞死亡或功能降低、引起超微結(jié)構(gòu)、功能、代謝及電生理方面發(fā)生進(jìn)一步的損傷，根據(jù)缺血時(shí)間的長短其表現(xiàn)形式也各有不同，分別為血管損傷、再灌注心律失常以及心肌梗死[19]。缺血時(shí)間小于5 min的心肌處于血管性損傷狀態(tài)，若此時(shí)恢復(fù)再灌注后缺血心電圖迅速恢復(fù)正常狀態(tài)，心肌的收縮和舒張功能能夠迅速恢復(fù)正常；缺血時(shí)間在5～20 min的心肌功能、形態(tài)結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生較大改變，再灌注后主要表現(xiàn)為心律失常；缺血時(shí)間大于或等于30 min的心肌處于不可逆性損傷狀態(tài)，直接造成心肌梗死。在實(shí)驗(yàn)過程中，為模擬臨床病理狀態(tài)，心肌細(xì)胞形成不可逆性損傷，缺血時(shí)間一般定為30～40 min[16]。

2.3.2 再灌注時(shí)間 缺血30～40 min后，將實(shí)心玻璃絲引線拉出來，進(jìn)行再灌注，大量氧自由基生成，其通過不飽和脂肪酸作用引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成丙二醛（MDA），通過多種途徑破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，另外，氧自由基還能促進(jìn)鈣超載，胞漿內(nèi)游離鈣的增加進(jìn)一步加速自由基的產(chǎn)生，加重再灌注損傷[20]。實(shí)驗(yàn)證明，造模過程中的再灌注時(shí)限呈多樣化，再灌注1、2、3 h到24 h等，模型建立后心肌梗死面積均在20%～30%，表明MIRI模型在各種在灌注時(shí)限均可建立成功[21-24]。因此在實(shí)驗(yàn)研究中，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，采取不同的再灌注時(shí)間以及采用再灌期間連續(xù)給藥的方式，來評(píng)價(jià)藥物的治療效果[12]。

3 術(shù)后處理

結(jié)扎后將心臟輕輕地迅速推進(jìn)胸腔，選擇三角針、最細(xì)型號(hào)縫線，右手持文式止血鉗稍微提起胸部肌肉，左手迅速沿與切口垂直方向擠壓胸腔[25]。采用肌腱縫合的方法按層次由深到淺分層，將相同類型的組織對(duì)齊縫合，以組織對(duì)合后不發(fā)生裂隙為宜，勿留死腔，以防積血、積液延緩傷口愈合和感染，由于肌肉分離的較碎、肋間肌肉較薄不易縫合，縫合過程中要用小針細(xì)線，避免打結(jié)脫線導(dǎo)致氣胸，提高模型成功率。手術(shù)結(jié)束后，將大鼠放在電熱毯上（37℃）至蘇醒，存活的大鼠放入籠中單獨(dú)飼養(yǎng)（防止術(shù)后大鼠的傷口感染或者因血腥味相互打斗）直到取材時(shí)間，術(shù)后肌肉注射青霉素預(yù)防感染[26]或給予姜黃素[27]腹腔注射治療。

4 結(jié)語

綜上所述，模擬人類心肌梗死的病理現(xiàn)象，傳統(tǒng)建立MIRI模型的實(shí)驗(yàn)操作仍有較多缺陷，MIRI模型作為指導(dǎo)臨床研究、復(fù)雜藥效評(píng)價(jià)的重要方法需要不斷完善，其成功與否主要取決于以上幾個(gè)環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵性操作。組建MIRI模型的規(guī)范化造模流程是進(jìn)行心血管疾病研究和治療的根基，整個(gè)心血管疾病的研究工作都要圍繞建立成功的MIRI模型的基礎(chǔ)上展開，因此，建立MIRI模型的成功與否，對(duì)于其后一系列研究是否成功有著重要意義。

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Key troubles in reproducing myocardial ischemia and reperfusion injury in rats

HOU Meng-meng,XING Dong-mei,LIU Xuan,HUA Sheng-yu
（Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193, China）

The animal model of myocardial ischemia and reperfusion injury is a classic model in researching the preadaptation mechanism of myocardial ischemia,evaluating the therapeutic effect of the drugs of antimyocardial ischemia and irrhythmia.There are still many deficiencies in the classic experimental operation.It is necessary for the continuing improving some key techniques in modeling,strengthening the study on the preoperative treating,intra-operative procedure and post-operative nursing,analyzing the key troubles in reproducing these models of myocardial ischemia and reperfusion injury and providing the resolving method and establishing a normal process in modeling myocardial ischemia-reperfusion injury.

model of myocardial ischemia reperfusion injury;key trouble;preoperative treatment;intraoperative procedure;postoperative care

R541.4

：A

：1673－9043（2014）06－0323-04

2014-08-20）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202798）；教育部“創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”資助項(xiàng)目（IRT1276）；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20110208）。

侯夢(mèng)夢(mèng)（1991-），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治心腦血管疾病的中藥藥理學(xué)研究。

華聲瑜，E-mail:bravo2008@163.com。