萬晨光 馮學(xué)泉 李 牧△ 杜洪印 張瑋曄 史 源 劉 蕾 沈中陽

實(shí)驗(yàn)研究

改良豬腦死亡模型的建立*

萬晨光1馮學(xué)泉1李 牧1△杜洪印2張瑋曄3史 源3劉 蕾3沈中陽3

目的 建立一種穩(wěn)定、可靠的豬腦死亡模型，為研究腦死亡模型建立過程中、腦死亡判定后的腦組織病理改變及器官移植免疫等變化提供一個(gè)更加穩(wěn)定的動(dòng)物模型。方法以經(jīng)典的硬膜外顱內(nèi)加壓法為基礎(chǔ)，在長白豬顱內(nèi)置入Codman有創(chuàng)顱內(nèi)壓監(jiān)測探頭，在實(shí)時(shí)監(jiān)測顱內(nèi)壓變化情況下，根據(jù)顱內(nèi)壓與平均動(dòng)脈壓（MAP）的關(guān)系進(jìn)行間斷顱內(nèi)加壓建立腦死亡模型。結(jié)果12例實(shí)驗(yàn)用長白豬，1頭死于麻醉意外，余11頭均成功誘導(dǎo)腦死亡模型。經(jīng)有效呼吸循環(huán)支持可維持腦死亡模型（31.3±4.7）h。通過經(jīng)顱多普勒、腦電圖、心電、MAP等監(jiān)測顯示，腦死亡模型制作過程中各參數(shù)變化平穩(wěn)，腦死亡判定后，動(dòng)物模型可長時(shí)間維持。結(jié)論在顱內(nèi)壓監(jiān)測條件下建立豬腦死亡動(dòng)脈模型的方法穩(wěn)定可靠，易于標(biāo)準(zhǔn)化，可為腦死亡模型建立過程中及腦死亡判定后的腦功能及器官移植免疫等研究提供更加穩(wěn)定的載體。

腦死亡；顱內(nèi)壓；模型，動(dòng)物；豬；硬膜外顱內(nèi)加壓

腦死亡（brain death，BD）是由哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院于1968年提出的現(xiàn)代死亡概念,指全腦功能不可逆性的喪失。腦死亡概念提出后，腦死亡患者成為器官移植的主要供體來源，但患者外周器官多有缺血、炎癥反應(yīng)[1]，使器官移植術(shù)后的治療更加復(fù)雜。本研究以經(jīng)典的“硬膜外顱內(nèi)加壓法”[2]豬腦死亡模型為基礎(chǔ)，應(yīng)用有創(chuàng)腦組織實(shí)時(shí)顱內(nèi)壓（intracranial pressure,ICP）監(jiān)測手段，根據(jù)ICP與平均動(dòng)脈壓（MAP）關(guān)系進(jìn)行緩慢間斷水囊加壓，建立了一種改良的腦死亡動(dòng)物模型，為研究腦死亡模型建立過程中、腦死亡判定后的腦組織病理改變及器官移植免疫變化等研究提供一個(gè)更加穩(wěn)定的載體。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康、清潔級(jí)長白豬12頭，體質(zhì)量（33.6±4.7）kg，雌雄不限，購自天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心，術(shù)前禁食12 h，禁水6 h。Codman顱內(nèi)壓監(jiān)護(hù)儀1臺(tái)，Codman腦組織型ICP監(jiān)測探頭1個(gè)，RIMED公司經(jīng)顱多普勒（transcranial doppler,TCD）儀器1臺(tái)、美國BIOPAC公司MP150 16通道生理信號(hào)記錄分析系統(tǒng)1套、harvard動(dòng)物手術(shù)臺(tái)1個(gè)、Matrx model3000麻醉機(jī)及Beneview T8麻醉監(jiān)護(hù)儀各1臺(tái)。

1.2 方法 （1）麻醉。臀部注射10 mg地西泮鎮(zhèn)靜，肌內(nèi)注射阿托品1 mL（0.02～0.05 mg/kg）抑制呼吸道分泌物，10 min后給予基礎(chǔ)麻醉：肌內(nèi)注射氯胺酮300 mg（10～30 mg/kg）。仰臥位固定豬，尾部脫毛放置氧飽和度探頭。氣管插管后，予以維庫溴銨維持全身麻醉，膀胱造瘺置入尿管并固定，外接尿袋。（2）動(dòng)、靜脈置管。頸部手術(shù)暴露頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)靜脈，直視下單側(cè)頸外動(dòng)脈切開，向近心端插入導(dǎo)管并固定，外接三通，連接監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測心電圖（ECG）、血壓（BP）；雙側(cè)頸內(nèi)靜脈球部插管，肝素封管以備行血?dú)夥治?，股靜脈插管以液體支持。（3）放置Foley水囊及顱內(nèi)壓監(jiān)測探頭。氣管及血管插管后改變實(shí)驗(yàn)豬體位，使其俯臥位，頂部去毛，切開頭皮，雙眼連線與正中矢狀線交點(diǎn)后1 cm處行顱骨鉆孔術(shù)，暴露硬腦膜，鈍性分離骨窗周圍硬腦膜與顱骨，置入14號(hào)Foley水囊導(dǎo)管后用骨蠟封閉鉆孔處，縫合頭皮。鉆孔處后1 cm，右側(cè)旁開2 cm處電鉆錐顱，置入Codman腦組織型ICP監(jiān)測探頭并固定，探頭距頭皮2.5 cm，外接ICP監(jiān)護(hù)儀。（4）置入針狀電極。電鉆錐顱，第一對(duì)電極針（FP1、FP2）置于基線（雙眼眶內(nèi)側(cè)連線）前2 cm，矢狀線左右各1 cm；另一對(duì)電極針（F7、F8）置于基線后1 cm，矢狀線左右各3 cm；第三、四對(duì)電極針置于基線后2.5、4 cm，矢狀線左右4 cm，連接MP150 16通道生理信號(hào)記錄分析系統(tǒng)行腦電圖（EEG）監(jiān)測。（5）顱內(nèi)加壓。腦死亡誘導(dǎo)前觀察豬ICP、MAP、心率（HR），穩(wěn)定10 min后，緩慢間斷以0.5 mL/min速度向顱內(nèi)氣囊導(dǎo)管內(nèi)注射生理鹽水加壓，當(dāng)ICP＞MAP時(shí)停止加壓，待MAP上升大于ICP時(shí)繼續(xù)加壓，直至MAP不隨ICP上升為止。

1.3 腦死亡判定時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn) 顱內(nèi)加壓停止1 h后停止麻醉支持，繼續(xù)予以呼吸機(jī)輔助呼吸，待麻醉停止1 h后對(duì)實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行腦死亡判定。參考我國于2009年頒布的《腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)（成人）》[3]，擬定腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）瞳孔對(duì)光反射消失。（2）角膜反射消失。（3）刺激豬頭面部，實(shí)驗(yàn)豬無反應(yīng)。（4）無自主呼吸。（5）TCD顯示前循環(huán)、后循環(huán)顯示振蕩波、尖小收縮波或血流信號(hào)消失。（6）腦電圖顯示電靜息。（7）阿托品試驗(yàn)陰性。首次判定12 h后再次復(fù)查，結(jié)果仍符合腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)者，方可最終確認(rèn)為腦死亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 模型成功率及維持時(shí)間 12頭實(shí)驗(yàn)長白豬中1頭死于麻醉意外，余11頭均成功誘導(dǎo)腦死亡模型，經(jīng)有效呼吸循環(huán)支持可維持腦死亡模型（31.3±4.7）h。

2.2 ICP及MAP情況 在顱內(nèi)加壓前，ICP為（16.2±3.8）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），MAP為（82.3±11.3）mmHg。顱內(nèi)加壓初期，ICP上升緩慢，MAP波動(dòng)不明顯，隨著繼續(xù)加壓，ICP劇烈升高，MAP隨之急劇升高，停止加壓后ICP可達(dá)（109.4±9.8）mmHg，MAP可升至（107.4±5.9）mmHg。ICP和MAP在較高水平相持一段時(shí)間后，MAP先于ICP開始緩慢下降，后MAP穩(wěn)定于（62.3±12.1）mmHg，ICP穩(wěn)定于（51.2±9.7）mmHg。

2.3 心率、心電變化 顱內(nèi)加壓前心率波動(dòng)于（103.3±12.1）次/min，律齊，各波形正常。顱內(nèi)加壓初期，心率稍有下降，后隨ICP增高而增快，高達(dá)（204.4±31.2）次/min，S-T段壓低。診斷為腦死亡后心率波動(dòng)于（127.2±14.4）次/min，各波均存在，S-T段壓低，未見明顯心律失常；在實(shí)驗(yàn)豬自然死亡前頻繁出現(xiàn)二聯(lián)律、三聯(lián)律，后出現(xiàn)室顫波形，血壓不能維持，短時(shí)間內(nèi)實(shí)驗(yàn)豬心跳停止。

2.4 TCD的變化 在行顱內(nèi)加壓前通過顳窗行TCD檢查，大腦中動(dòng)脈流速（VMCA）為（64.5±5.8）mm/s，開始顱內(nèi)加壓后，VMCA逐漸下降，當(dāng)收縮壓＞ICP＞舒張壓時(shí)，TCD顯示大腦中動(dòng)脈（MCA）頻譜出現(xiàn)舒張期逆向血流。MAP及ICP開始下降后，短時(shí)間內(nèi)MCA頻譜變?yōu)檎袷幉?、尖小收縮波。

2.5 腦電圖的變化 顱內(nèi)加壓初期，EEG顯示廣泛的爆發(fā)，即抑制波形，隨著ICP升高，腦電活動(dòng)減弱，潛伏期延長，波幅降低，MAP及ICP開始下降后腦電圖快速變?yōu)殪o息電位，無自主和（或）誘發(fā)腦電活動(dòng)。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇 目前已有研究描述了用鼠[4]、貓[5]、狗[6]等動(dòng)物腦死亡模型的建立，本研究以體質(zhì)量35 kg左右的長白豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)環(huán)境及動(dòng)物麻醉要求較高，且有以下優(yōu)點(diǎn)。首先，豬在解剖學(xué)、生理學(xué)、血液學(xué)及疾病發(fā)生機(jī)制等方面與人極其相似，目前已作為人類疾病動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)生物醫(yī)學(xué)研究。其次，可行頸動(dòng)脈或頸內(nèi)靜脈置管，行有創(chuàng)動(dòng)脈壓、中心靜脈壓監(jiān)測；可行顱骨鉆孔硬膜外置入加壓水囊，并同時(shí)行錐顱置入顱內(nèi)壓監(jiān)測探頭、腦電監(jiān)測探針等；可方便行經(jīng)顱多普勒監(jiān)測腦血流，更好地模擬臨床情況，這些都是小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所不能比擬的。

3.2 實(shí)驗(yàn)方法的選擇 腦死亡模型制作包括頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎法、呼吸暫停法[7]、硬膜外加壓法[8]、顱內(nèi)制造血腫法[9]、斷頭法等。目前應(yīng)用較多的為經(jīng)典的硬膜外水囊加壓法，其方法為顱骨中線處鉆孔，于硬膜外置入Foley水囊，向水囊注水加壓，通過升高顱內(nèi)壓使腦組織缺血缺氧從而進(jìn)行腦死亡模型的誘導(dǎo)。模型制作的關(guān)鍵在于向水囊加壓注水的速度及總量，但報(bào)道的速度為0.05～3 mL/min不等[8,10]，總量8～50 mL，差異較大。由于在加壓過程中缺乏ICP監(jiān)測，且ICP的變化與顱腔容積之間呈指數(shù)關(guān)系，故單以注水速度為指標(biāo)進(jìn)行加壓較盲目，以致建立起的腦死亡模型個(gè)體差異大、穩(wěn)定性差，不能準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)腦死亡后機(jī)體生理生化的變化。本研究對(duì)經(jīng)典的硬膜外水囊加壓法進(jìn)行了改良，其核心即在實(shí)時(shí)ICP監(jiān)測的條件下緩慢增高顱內(nèi)壓力，使其達(dá)到MAP水平，使腦灌注壓（cerebral perfusion pressure，CPP=ICP-MAP）為零，進(jìn)而致全腦缺血、缺氧，引起全腦功能不可逆性喪失，誘導(dǎo)腦死亡模型。

3.3 動(dòng)物模型的生命體征變化及維持時(shí)間 本研究表明，在行加壓初期，ICP升高緩慢，隨著繼續(xù)加壓，ICP急劇升高，符合體積—壓力曲線變化；初期，MAP變化并不明顯，后隨ICP增高而急劇升高，推測是由于CPP不足以維持顱內(nèi)血供，機(jī)體對(duì)ICP增高引起腦組織缺血代償反應(yīng)，MAP反射性增高。ICP與MAP在較高水平維持短時(shí)間后，MAP先于ICP開始下降，此時(shí)腦血流量自動(dòng)調(diào)節(jié)功能已喪失，實(shí)驗(yàn)豬已瀕臨腦死亡。在實(shí)時(shí)ICP監(jiān)測的條件下進(jìn)行腦死亡模型的誘導(dǎo)，此方法簡便、易行，由于可通過ICP、MAP調(diào)整注水加壓的速度，模型制作過程穩(wěn)定，一方面可防止ICP升高過快或過高對(duì)腦組織造成不必要的損傷，另一方面也可防止ICP過度波動(dòng)造成動(dòng)物循環(huán)、心臟功能的大幅波動(dòng)。

本研究表明，在實(shí)時(shí)監(jiān)測ICP的條件下，緩慢間斷硬膜外水囊加壓方法建立豬腦死亡模型的過程穩(wěn)定，模型成功率高、易于標(biāo)準(zhǔn)化，可為腦死亡過程中腦功能、器官移植免疫等方面的研究提供了一個(gè)更加符合生理的動(dòng)物模型。

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（2013-11-19收稿 2013-12-02修回）

（本文編輯 李鵬）

讀者·作者·編者

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Establishment of Modified Brain Death Model in Pig

WAN Chenguang1,FENG Xuequan1,LI Mu1,DU Hongying2,ZHANG Weiye3,SHI Yuan3,LIU Lei3,SHEN Zhongyang3
1 Department of Neurosurgery,2 Department of Anesthesia,3 Department of Transphant,First Central Clinical Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300192,China

ObjectiveTo establish a stable and reliable model of brain death in swine,and to provide a more stable model for investigating pathomorphology in brain tissue and for studying transplantation immunology during brain death.MethodsBase on the classic methodology of increasing epidural intracranial pressure,Codman intracranial pressure monitoring probes were implanted in landrace pigs invasively.According to the relationship between ICP and MAP,brain death models were established by increasing intracranial pressure slowly and intermittently,with real-time monitoring of the intracranial pressure.ResultsAmong twelve experimental landrace pigs,one died from anesthetic accident,while the rest eleven were successfully established as brain death models.With effective respiratory and circulatory support,those brain death models can be maintained for(31.3±4.7)h.Brain death model establishement is a stable and reliable process demonstrated by transcranial Doppler,EEG,ECG,mean arterial blood pressure and other monitoring methods.After brain death is confirmed,animal models can be maintained for a long time.ConclusionOur methodology of inducing brain death model under ICP monitoring is stable and easy to be standardized.It can also provide a more stable model for studying brain tissue pathomorphology and transplantation immunology.

brain death；intracranial pressure；models,animal；swine；epidural intracranial pressure

R339.39

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.009

*國家863計(jì)劃（項(xiàng)目編號(hào)：2012AA021001）；衛(wèi)生部2011年度國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：衛(wèi)辦醫(yī)政函[2011]873）

1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院神經(jīng)外科（郵編300192），2麻醉科，3移植外科

△通訊作者 E-mail：Limu5333@163.com